MODELOS ANIMALES DE
ENFERMEDAD EN INVESTIGACIÓN
TRANSLACIONAL
Virginia Hernández Gea
Laboratori de Recerca Translacional d’Oncologia Hepàtica
BCLC group. IDIBAPS. Hospital Clínic
MODELOS ANIMALES
Desarrollo de tratamiento de muchas enfermedades humanas
• Desarrollo tratamientos (tratamiento de DM con insulina en perros)
• Validación mecanismos de acción (tratamiento de asma con antiIL5 en roedores y primates )
• Estudios de seguridad /Eficacia (toxicidad de penicilina Ginea pigs)
Avances en investigación del genoma y biología molecular
ELEGIR EL MODELO ADECUADO
No hay modelos disponibles para todas las enfermedades
Determinadas condiciones etiología-especifica no son patogénicas en
animales
• Virus de la Hepatits C virus no afecta roedores
La respuesta a un determinado agente inductor puede cambiar entre
animales y humanos
CARACTERÍSTICAS DEL MODELO ANIMAL IDEAL
SIMILITUD CON LA
ENFERMEDAD HUMANA
• Patogénesis y fenotipo similar
a la enfermedad en humanos
• Reflejo de interacciones
celulares y moleculares
(microambiente)
• Similares biomarcadores de
enfermedad
• Predicción fiable de toxicidad y
respuesta a terapias aprobadas
en humanos
OTRAS CONSIDERACIONES
• Reproducibilidad
% animales que alcanzan el estadio de interés
• Especificidad
alteración deseada sin otras complicaciones
• Coste directo e indirecto
mantenimiento colonia
• Seguridad
riesgo para el personal
• Tamaño
volumen de sangre requerido, accesos
vasculares, cantidad fármaco
• Ética
aceptabilidad del modelo
• Viabilidad del modelo
experiencia en el laboratorio, mano de obra
DESARROLLO HEPÁTICO
La formación del hígado empieza 60-72 horas post-fertilización
El hígado esta completamente desarrollado a los 5 días
El desarrollo hepático es independiente de la vasculogenesis
Ventajas
Camadas de gran número
Creación de transgénicos es fácil, rápida y barata
Manipulación genética unida a fluorescencia permite
visualización en tiempo real de todo el proceso de desarrollo
Chu & Sadler. Hepatology 2009
HEPATITIS AGUDA POR VHC
No modelos en animales pequeños que reproduzca todo el ciclo infección
La inoculación virus en roedores (incluso inmunodeprimidos) no produce
infección detectable
Chimpancé
• Permite el estudio de todos los pasos del ciclo vital de la infección
Replicación/Infección/Producción virus
• Modelo immunocompetente
Estudio de la respuesta inmune huésped (innata & adaptativa)
• Permite analizar cambios precoces en la expresión génica
Obtención muestras tras infección aguda
• Probar de forma directa agentes antivirales
• Único modelo para el estudio y desarrollo de vacunas
• Limitaciones
• Éticas
• Escasa disponibilidad
• Coste prohibitivo
Bukh J. Gastroenteroogy 2012
USO DE RATONES
VENTAJAS
• Genética/bioquímica y
fisiológicamente similares
• Habilidad para manipular su
genoma
• Rápida reproducción
• Mínima variabilidad biológica
• Disponibilidad de histología
postmortem
USO DE RATONES
VENTAJAS
• Genética/bioquímica y
fisiológicamente similares
• Habilidad para manipular su
genoma
• Rápida reproducción
LIMITACIONES
• Diferencias propias de la especie
• Diferente talla/ ciclo
vital/morfología de los órganos
• Actividad de la telomerasa
• Mínima variabilidad biológica
• Escaso desarrollo de metástasis o en
localizaciones distintas
• Disponibilidad de histología
postmortem
• Diferencias en vías de señalización y
metabolismo
• Distinto microambiente y sistema
inmune
COMPLICACIONES DE LA CIRROSIS
HIPERTENSIÓN PORTAL
HEMORRAGIA POR
HIPERTENSIÓN PORTAL
Ligadura parcial de la Vena Porta
Sección rama de la Vena Ileocólica
• Fácil, reproducible y de bajo coste
• Desarrollo de HTP muy rápido (máx 24h)
• Una semana tras la LPVP , desarrollo
completo del sme HTP (circulación
híperdinámica, shunts porto-sistémicos)
• Caracterizado en LPVP y BDL
• La severidad de la hemorragia depende del
grado de hipertensión portal y del tamaño
de la rama seccionada
• Buen modelo para testar drogas vasoactivas
en condiciones hipovolémicas
Abraldes et al. World J Gastroenterol 2006
COMPLICACIONES DE LA CIRROSIS / FIBROSIS
ENCEFALOPATIA HEPÁTICA
Shunt Portocava en ratas
•
•
•
•
Bypass portosistémico sin fallo hepático
Cambios comportamiento
Reversible con tratamiento anti-EH
Buen modelo para estudio EH y
desarrollo de nuevos fármacos
FIBROSIS POR ALCOHOL
Modelo Lieber–DeCarli
• Reproduce la mayoría de los rasgos
patológicos de la enfermedad
hepática por alcohol
• Dieta semilíquida que aporta etanol
como el 36% de las calorías totales
• Ad libitum como única fuete de
alimento y líquido
• Fibrosis pericelular y perivenular
progresiva
• Aparición de cirrosis en 1/3 de los
animales después de una exposición
tras 1-3 años.
Díaz-Gómez et al. Rev Esp Enferm Dig. 2011
FIBROSIS
TETRACLORURO DE CARBONO
• Necrosis centro-lobulillar aguda
• Respuesta reparadora inmediata
• Reclutamiento de células inflamatorias
• Incremento de matriz extracelular
•
•
•
•
Fibrosis significativa tras 2-4 semanas
Cirrosis micronodular en 12 semanas
Administración ip / inhalación
DEN (Diethylnitrosamine) + CCl4 reproduce la
secuencia daño hepático / fibrosis /
transformación maligna
TIOACETAMIDA (TAA)
• Fibrosis periportal
• Cirrosis macronodular en 12
semanas
• Administration: i.p. / agua
Abraldes et al. World J Gastroenterol 2006
FIBROSIS
LIGADURA COLÉDOCO
• Cirrosis biliar primaria.
• Especialmente apropiado en ratas
(no tienen vesícula biliar)
• Desarrollo de fibrosis-cirrosis biliar
en 4-6 s
• Proliferación colangiocitos y fibrosis
portal
• Demuestra la importancia a de los
miofibroblastos periportales
Arias M et al. BMC Gastroenterology 2003
INMUNOLOGICAMENTE MEDIADA
Concanavalin A
• Injección iv durante 20
semanas
• Fibrosis centrilobular y
perisinusoidal
Schistosoma mansoni
• Exposición percutanea
produce granulomas y
fibrosis periportal
MANIPULACIÓN GENÉTICA
Gen de interés
Pérdida de función
Knock-down
RNAi
Ganancia de función
Knock-out
Transgénico
Control Espacial
& Temporal?
Control
Espacial &
Temporal?
No
Sí
No
Reversible?
Conventional
knockout
Sí
No
Cambio
esporádico?
No
Knock-out
condicional
Inducible
system
Sí
Virus-mediated
delivery
Expresión Tejido
específica?
No
Transgénico
con
promotor
ubicuo
Sí
Transgenico
con
promotor
Tejidoespecífico
Knock-in
Control
Espacial &
Temporal?
Sí
Sí
• Condicional
(Cre-Lox)
• Inducible
(Tet)
No
Knockin
Convencional
FIBROSIS
RATONES KNOCK OUT
ATP-binding cassette (ABC) B4 (ABCB4-/-)
Defecto en el transporte de fosfolípidos desde los hepatocitos al luz canalicular
Desarrollo espontáneo de fibrosis
LIM homeobox gene (Lhx) 2 (LHX2-/-)
Ratones deficientes en LHX2 desarrollan fibrosis hepática espontánea y progresiva
durante el desarrollo embrionario (día 14) semanas del nacimiento
El gen de interés se reemplaza (knock out) mediante
selección antibiótica (Neomicina)
Inyección embrión
y Reproducción
FIBROSIS
COMBINACIONES
Hepatotoxinas: CCl4/TAA con Modificación genética tejido específica (sistema Cre LoxP)
La deleción del gen Atg7 específicamente en HSC aminora el desarrollo de fibrosis tras
provocación daño hepático con hepatotoxinas.
PROMOTOR
LOX
Atg7
LOX
GFAP-cre
GFAP
PROMOTOR
Atg7F/F
CRE
Deleción gen interés en
celulas estrelladas
Homocigotos Atg7flox/flox GFAP-Cre
(Knockout Atg7 específicamente en
células estrelladas)
Hernandez-Gea et al. Gastroenterology 2012
FIBROSIS
RATONES TRANSGÉNICOS
Sobreexpresión de Tgf-β1 en hepatocitos (ALBUMIN-Promoter)
Sobreexpresión de PDGF-C en hepatocitos
Cambios morfológicos a las 2 semanas de edad con fibrosis prominente a las 6 semanas
HCC entre 6 meses-1 año. Reproduce los pasos de desarrollo de HCC que ocurren en humanos
(esteatosis, fibrosis, displasia, neoangiogenesis y malignización)
Doyle A et al.Transgenic Res (2012)
HEPATOCARCINOMA
DOBLE TRANSGÉNICO
Myc/TGFα
TGFa bajo el promotor metalotionina. Myc bajo el promotor albúmina
20% de los ratones transgénicos para ambos genes desarrollan HCC a los 4
meses y el 100% a los 8-10 meses.
Co-expresión de Myc y TGFa induce tumores con alto grado de inestabilidad
genética, aneuplodia y alta proliferación similar a los HCC de mal pronóstico
Factor VM et al. J Biol Chem 1998
Sobreexpressión hepática de linfotoxinas α y β
Control
LTαβ
LTαβ
Selectivamente en hepatocitos
Hepatitis crónica a los 9 meses
HCC a los 12 meses
Johannes Haybaeck et al. Cell 2009
TRANSGÉNICOS CONSTITUTIONALES
LIMITACIONES
Letalidad embrionaria / infertilidad
El gen alterado puede ser vital para el desarrollo normal
Variabilidad en el patrón de expresión
Poco control sobre el sitio de integración y el nº copias del DNA insertado
Puede que la proteína truncada todavía retenga actividad biológica
No mimetiza la secuencia de eventos presentes en la tumorogenesis espontánea
Mutación esta presente en todas las células alteradas y desde el principio
El transgen se integra en los dos alelos del genoma del animal
Tanto las células tumorales como estromales expresan el transgen
Disponibilidad limitada de promotores tejido-específico
HEPATOCARCINOMA
TRANSGÉNICOS INDUCIBLES
Raton transgénico con delección del oncogen Myc específica en hígado e inducible
Proteína tTA bajo el control del promotor LAP (Liver activator promotor) capaz de unirse
en hígado a celulas que expresan secuencia específica TetO
Myc bajo el control de protor TetO-CMV
El tratamiento con Doxicilina en estos animales previene la expressión de Myc.
Discontinuación de doxiclinia a las 3 semanas de edad activa la expressión de Myc (Tet-Off) y los ratones
que expresan Myc desarrollan HCC a las 12 semanas
Doxi
LAP
TetO
TetR
CMV
LAP
VP16
TetR
VP16
No expresión
Myc
Expresión gen interés
Shachaf CM et al. Nature 2004
INTEGRATIVE ONCOGENOMIC (MICE TO HUMAN)
Firma genética generada en hepatocitos primarios de ratón basada en
la expresión temporal del gen TGFβ es capaz de identificar distintos
subgrupos de HCC en humanos
Coulouarn C et al. Hepatology 2008
INTEGRATIVE ONCOGENOMIC (MICE TO HUMAN)
En humanos los dos subgrupos generados presentan diferencias en
supervivencia, origen de células tumorales (hepatoblastos vs hepatocitos),
expresión c-Met/HGF, HBV status.
Coulouarn C et al. Hepatology 2008
IDENTIFICACIÓN DE NUEVOS ONCOGENES
Análisis de expresión para comparar anomalías genómicas (amplicones) entre ratón y
humano. Los eventos recurrentes sirven como filtro para identificar los genes candidatos.
Una vez identificados se evalúa su funcionalidad en cuanto actividad tumoral o metastásica
p53−/− con sobreexpresión de Myc (marcage GPP)
Identificación de oncogenes cIAP1 y Yap
Zender L et al. Cell. 2006
XENOGRAFTS
Células tumorales
en cultivo
Inyección subcutánea
de células
Inyección de células tumorales humanas o fragmentos de tumor de
forma subcutánea u ortotópica en ratones inmunodeficientes
Crecimiento tumoral con el soporte del estroma y vasculatura murina
Formación de nódulo tumoral en 2–6 semanas tras implantación
Pilar principal de los estudios preclínicos para el desarrollo in vivo de
nuevos medicamentos
DESARROLLO NUEVOS TRATAMIENTOS
Inyección ≈ 106 células en ratón
inmunodeprimido
Cultivo de células
tumorales
Tratamiento durante
2-6 semanas
Tras inyectar células tumorales, los ratones se tratan con el compuesto de
interés durante 2-6 semanas tiempo durante el cual se desarrolla el tumor.
Es estudio es positivo si el compuesto de interés reduce le crecimiento tumoral
Sharpless & DePinho. Nature Reviews Drug Discovery 2006
XENOGRAFTS
VENTAJAS
• Fácil uso y bajo coste
• Células tumorales
representativas de tumores
reales (complejidad genética)
• Evaluación del volumen tumoral
y crecimiento tras tratamiento
• Nuevas terapias:
• diferentes dosis
• esquemas de tratamiento en
el mismo set de células
• Gran ayuda para priorizar los
compuestos que pasaran a Fase I
DESVENTAJAS
• Inmunosupresión huésped
•
•
SCID mice (severe combined
Immunodeficience) tienen defectos en los
mecanismos de reparación del DNA
Nude mice ( alteración timica ): fragilidad
general que limita su tolerancia y resistencia
a fármacos
• No sirve para evaluar tratamientos
inmunomoduladores
• No recapitulan completamente la
heterogeneidad intratumoral ni el
microambiente
• Eficacia quimioterapéutica es
sensible pero poco específica
•
Hasta 89% de fármacos que superan los
estudios preclínicos nunca llegan a ser
aprobados
QUIMERAS / TRASPLANTE HUMAN-IN-MOUSE
Células cancerígenas humanas se implantan en un tejido
adyacente normal
Fácil/ Rápido/ Coste efectivo
Valoración interacciones tumor-estroma (quimeras)
Desarrollo y validación de nuevos fármacos
Heyer J et al. Nature Reviews Cancer. 2010
MODELO ANIMAL IDEAL
Biología Molecular
Fisiopatología
Screening
Identificación Biomarcadores
Histopatología
Determinantes
de progresión
metastásica
Estudios Imagen
in vivo
Análisis genoma
Perfil molecular
Desarrollo Fármacos
Quimioresistencia
GEMM
Carcinogénesis
Influencia
factores
ambientales
CONCLUSIONES
• El perfecto modelo animal todavía esta por generar
• En cáncer, no existe el modelo que recapitule todos
los estadios del desarrollo del tumor
• Diferencias interespecies obligan a seguir utilizando
material humano
• Entender las ventajas y limitaciones de cada modelo
es necesario para maximizar la rentabilidad de los
modelos disponibles
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ModelosAnimalesAEEH2013