Generación de mutantes en Drosophila
•Agentes mutagénicos o químicos:
mutantes puntuales
•Rayos X-g :
rearreglos cromosómicos (deleciones, inversiones, translocaciones)
•Movilización del elemento P (Transposón):
mutantes insercionales (disrupción del gen por la inserción del P)
Ventaja: mapear el sitio de inserción para identificar el gen afectado
Sitio etiquetado por el P
Transposones
-
Elementos geneticos moviles
Secuencias de tipo viral
Importancia en evolucion de genomas eucariotas
Transposones de DNA o RNA (retrotransposones)
Elemento P!!!
Elemento P
•Transposon de Drosophila capaz de movilizar dentro del genoma
•Transposición no replicativa y sin intermediario
•La enzima transposasa :
-Es necesaria para la movilización del P, reconoce las secuencias
invertidas
-Es codificada por el mismo transposon o por fuente externa (otro P)
-Adición o remoción para controlar los eventos de transposición
•Inserción al azar dentro del
genoma (no es por recombinación
homóloga)
•Herramienta genética para
manipulear el genoma de
Drosophila
Elemento P como herramienta genética y molecular
Uso de colección de moscas
depende del objetivo planteado
1) Identificar genes involucrado en
determinada función biológica
Desregular la expresión de genes
o generar mutación insercional
2) Identificar genes que se
expresen en determinado tejido
Reportar la expresión de genes
3) Expresar secuencia clonada en
el P en un determinado tejido
Líneas transgénicas estables
Elemento P (modificado molecularmente) :
-Repeticiones invertidas para transponer
-No contiene transposasa
-Marcador white+ en background white
wild
type
white
Colección de mutantes insercionales
moscas con elemento P
a movilizar
x moscas con transposasa
(P modificado)
Transposición no replicativa en el embrión
Mosaico
P transpuesto en algunas células (parche rojo)
Progenie: cada individuo posee el P insertado en algún lugar al azar
dentro del genoma
Es importante remover la fuente de transposasa realizando un 2º
cruzamiento
Colección de mutantes insercionales
Mapear el P en
cada línea de la
colección
Objetivo:
Identificar genes involucrados en determinada función biológica
Screen o búsqueda genética empleando una colección de mutantes
Colección de moscas: conjunto de moscas que poseen elemento P
insertado al azar en el genoma
ventajas del elemento P
Testear todas las líneas que conforman la colección de moscas
Seleccionar las líneas que presentaron el fenotipo buscado
Mapear el elemento P en la línea de mosca seleccionada
Mapeo del sitio de inserción del P dentro del genoma
-genético (cromosoma, región)
-citológico (hibridación in situ en cromosomas politénicos)
-molecular (rescate plasmídico)
Rescate plasmídico:
Digestión del DNA genómico
Ligación
Amplificación por PCR
con primers específicos en el P
Secuenciación
Identificar el sitio de inserción
en el genoma de Drosophila
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Movilización del elemento P