Química Biológica Patológica
Técnicas de Biología Molecular
aplicadas a Bioquímica Clínica
2014
Tema 1
 Dra. Silvia Varas
[email protected]
Objetivos
Historia Local
•1989- PCR
1993- Premio Nobel a Kary Mullis
≈20-25 años
10 años desde fin secuenciamiento
ADN genómico humano
Cual es la realidad local?
2000- 1º termociclador Perkin Elmer
2014- UNSL:5-10 termocicladores; 1
tiempo real
Otros: CSSL- Lab de Huellas Digitales

Usos?
 PCR
Humanos: mutaciones, filiación?
 Microbiológicos
 Virales?
 Plantas
 Hongos?
 Modelos animales: RT-PCR

Tema 1
Genoma Humano: constitución
 Proyecto Genoma Humano
 Controversias Éticas
 Mutaciones mas comunes según
Human Gene Mutation Database
 Deleciones y Mutaciones puntuales
 Estrategias de laboratorio

Genoma Humano
Se llama genoma a la totalidad del
material genético de un organismo.
 Su detallado conocimiento esta ligado
al proyecto genoma humano
 En 1986 el Dpto de Energía y los Dptos
de Salud de los EEUU lideró la iniciativa
y puso en marcha el mayor proyecto
biomédico de la historia. Oficialmente
se inicia en octubre 1990. Hasta
conseguir la secuenciación completa en
2005.

Objetivos:





Identificación y localización (cartografía) de los genes en el
genoma humano
Mantenimiento de los bancos de datos de acceso publico
Creación de herramientas para el análisis de datos
Transferencia de tecnología relacionada al sector privado.
Supervisión de temas éticos legales y sociales derivados del
Proyecto Genoma
HERRAMIENTAS DE CARTOGRAFIA
Cartografía o mapeo genético: Mapas de ligamiento y mapas
físicos
 SECUENCIACION: Método de secuenciación desarrollado por
Frederick Sanger

Proyecto Genoma Humano

En 1990 se inició oficialmente.

Un proyecto paralelo se realizó
fuera del gobierno por parte de la
Corporación Celera. La mayoría
de la secuenciación se realizó en
las universidades y centros de
investigación de los EEUU,
Canadá, Nueva Zelanda, Gran
Bretaña y España.

En el etapa de mayor actividad
del programa se secuenciaba
1000 nt/seg.
Francis Collins (director del
CONSORCIO Proyecto Genoma
Humano) y Craig Venter
(gerente de Celera Genomics)
Proyecto Genoma Humano:
representación


Si cada par de nucleótidos se
dibuja para abarcar 1 mm,
entonces el genoma humano se
extendería 3.200 kilometros lo
suficiente para cruzar la línea
a través del centro de África
(línea roja).
A esta escala, habría, en
promedio, un gen codificante
para proteína cada 130 m. Un
gen promedio se extendería por
30 m, pero las secuencias
codificantes de este gen podría
abarcar algo más de 1 metro.
Genoma Humano
International Human Genome
Sequencing Consortium (2001) Initial
sequencing and analysis of the human
genome. Nature 409, 860–933.
 International Human Genome
Sequencing Consortium (2004)
Finished: the euchromatic sequence of
the human genome. Nature 431, 931–
45.

Genoma humano


El genoma
humano haploide
consiste de 3200
millones pb de
DNA
Se suponía en un
principio que el
genoma humano
podría tener unos
50.000 a 100.000
genes genes
distribuidos en
los 23 pares de
cromosomas de la
célula
Genoma humano: Historia



Si 6.000 genes pueden producir una
levadura, y 14.000 a una mosca, ¿cuántos
se necesitan para codificar un ser, una
criatura compleja humano, curiosa y lo
suficientemente inteligente como para
estudiar su propio genoma?
Hasta que los investigadores completaron
el primer borrador de la secuencia del
genoma humano, la estimación más citada
fue 100.000. Pero ¿de dónde esa cifra?
¿Y de donde sale la nueva estimación de
sólo 25.000?

Walter Gilbert, un físico convertido en biólogo y
quien ganó el Premio Nobel por el desarrollo de
técnicas de secuenciación de ADN, fue uno de los
primeros en lanzar una estimación aproximada del
número de genes humanos.

A mediados de la década de 1980, Gilbert sugerido
que los humanos podrían tener 100.000 genes, una
estimación basada en el tamaño medio de los pocos
genes humanos conocidos en el momento
(aproximadamente 3x104 pares de nucleótidos) y el
tamaño de nuestro genoma (3x109 pares de
nucleótidos). Hizo un cálculo que produjo un
número con una redondez agradable tal, que terminó
siendo citado ampliamente en artículos y libros de
texto.
Comparación de secuencias de nucleótidos de muchos
vertebrados diferentes revela regiones de alta
conservación

La secuencia de nucleótidos
examinado en este
diagrama es de un pequeño
segmento del gen humano
para una proteína
transportadora de
membrana plasmática.

La secuencia del exón se
conserva en todas las
especies, incluyendo el
pollo y pescado. Tres
bloques de la secuencia del
intrón que se conservan en
los mamíferos, pero no en
la de pollo o pescado, se
muestran en azul. las
funciones de secuencias de
intrones más conservadas
en el genoma humano
(incluyendo estos tres) no
son conocidos.
Tipos de Secuencia

Tipos de secuencia


Altamente repetitiva: VNTR, STR
Mediamente repetitiva: LINEs,
SINEs, transposones
Copia Única
La mayor parte del genoma humano está compuesto de no codificante y secuencias de
nucleótidos repetitivos. Las LINEs, SINEs, transposones retroviral, y los transposones-ADN
son elementos genéticos móviles que se han multiplicado en nuestro genoma mediante la
replicación de sí mismos y la inserción de las nuevas copias en diferentes posiciones.
Las repeticiones simples son secuencias de nucleótidos cortas (menos de 14 pares de
nucleótidos) que se repiten una y otra vez durante largos períodos. Las duplicaciones de
segmentos son bloques grandes del genoma (1000-200.000 pares de nucleótidos) que están
presentes en dos o más lugares en el genoma.
Las secuencias únicas que no son parte de ningún intrones o exones (verde oscuro) incluyen
elementos reguladores de genes, así como las secuencias cuyas funciones no se conocen.
Los bloques más altamente repetidas de ADN en la heterocromatina aún no se han
secuenciado por completo; por lo tanto, cerca del 10% de las secuencias de ADN humano
que no están representados en este diagrama
Polimorfismos Repetitivos
VNTR (Variable number of tandem repeat),
Ej: [CTGATCTATAGTAC]n
STR, (Short tandem repeat),
Ej: [ CG ] n
Donde n= 20, 50 ó 70 veces
Elementos repetitivos



SINE (Short Interspersed Nuclear
Elements, elementos nucleares dispersos
cortos): elementos Alu, 250-280
nucleótidos, con unas 1.500.000 copias.
Los LINE (Long Interspersed Nuclear
Elements, o elementos nucleares
dispersos largos) constituyen un 20 por
ciento del genoma humano. Son
secuencias con un con un tamaño de
varias kilobases
Transposones ADN, retrovirales
ADN copia única
48x106=1,5%
A) El cromosoma 22, uno de los más
pequeños cromosomas humanos,
contiene 48 X 106 pares de nucleótidos
y constituye aproximadamente el 1,5%
de todo el genoma humano. La mayor
parte del brazo izquierdo del
cromosoma 22 se compone de
secuencias cortas repetidas de ADN
que son empacados ​en una forma
particularmente compacta de la
cromatina (heterocromatina).
(B) una expansión de diez veces de una
porción del cromosoma 22 muestra
unos 40 genes. los de color marrón
oscuro se conocen como genes y los
rojos se predice genes.
(C) una porción ampliada de (B) muestra
toda la longitud de varios genes.
(D) el arreglo intrón-exón de un gen típico se
muestra después de una ampliación de
diez veces más. cada exón (rojo) codifica
para una porción de la proteína, mientras
que la secuencia de ADN de los intrones
(gris) es relativamente poco importante.
(Adaptado de la Human Genome Sequencing Consortium International,
Nature 409:860-921, 2001
Proyecto Genoma Humano: ESTADISTICAS

Se estima que el genoma humano contiene en torno a los 20.000-25.000 genes.

Alrededor de un 50 por ciento del genoma humano está constituido por ADN
repetitivo.

Se puede estimar que la densidad media de genes es de un gen cada 100 kb,
aunque existen regiones ricas en genes (algunas zonas del cromosoma 19, por
ejemplo) y otras regiones que son muy pobres en genes (como el cromosoma Y).
Por tanto, se puede deducir una frecuencia media de 10 genes por cada Mb de
secuencia.

El tamaño promedio de un gen humano es de 20-30 kb, aunque hay grandes
diferencias de unos genes a otros.

El número de exones que forman un gen es muy variable (desde genes que tienen
un solo exón hasta algunos genes con 100 exones o más), pero podemos
establecer un valor promedio de 7-8 exones por gen.

El tamaño medio de un exón es de 150 nucleótidos. Por lo que respecta a los
intrones, en cambio, existe una enorme variabilidad de tamaños, y no es
infrecuente encontrar en casi todos los genes algún intrón de gran tamaño.

El tamaño medio de un ARNm es de 1,8-2,2 kb incluyendo las regiones notraducidas flanqueantes. La longitud media de una región codificante es de 1,4 kb.
Proyecto Genoma Humano: HALLAZGOS
El rasgo más notable del genoma humano es el pequeño porcentaje que codifica
para proteínas, RNAs estructurales y RNAs catalíticos. Casi la mitad del ADN
restante se compone de elementos genéticos móviles que han colonizado nuestro
largo genoma durante el tiempo evolutivo.
Una segunda característica notable del genoma humano es el tamaño grande del
promedio de los genes (27.000 pares de nucleótidos). Sólo se requieren
alrededor de 1.300 pares de nucleótidos que codifica una proteína de tamaño
medio (unos 430 aminoácidos en los seres humanos). La mayor parte del ADN
que permanece en un gen consiste en largos tramos de ADN no codificante en los
intrones y exones que codifican proteínas relativamente cortos Además de los
intrones y exones, cada gen se asocia con secuencias de ADN reguladoras que
aseguran que el gen se expresa en el nivel y el momento adecuado, y en el tipo
apropiado de célula. En los seres humanos, estas secuencias de ADN reguladoras
están normalmente distribuidos en decenas de miles de pares de nucleótidos,
mucha de la cual parece ser ADN "espaciador". Los exones y secuencias
reguladoras comprenden menos del 2% del genoma humano.
Otra característica sorprendente del genoma humano es su número relativamente
pequeño de genes. Las estimaciones anteriores habían sido de alrededor de
100.000. Aunque el número exacto todavía no está claro, estimaciones revisadas
indican que el número de genes humanos en alrededor de 25.000, nos compara
al números de genes de animales multicelulares más simples, tales como
Drosophila (14.000), C. elegans (19.000).
Proyecto Genoma Humano:
búsqueda del número de genes
En ADN genómico: cuando se busca en el recuento teórico del
número de genes se tuvieron se buscaron el número de ORFs
(open reading frames): secuencias de 100 codones comprendida
entre un codón de inicio (AUG) de la traducción y un codón de
terminación, descontando las secuencias que corresponden a los
intrones en caso de haberlas. Se encuentra acotado por los UTRs,
o secuencias no traducidas. Existen programas que son usados
para la búsqueda de ORFs, los cuales se inician con el codón
ATG, y terminan con un codón de terminación TAA, TAG, o TGA.
El marco de lectura abierto quedará definido, por tanto, cuando
el codón de inicio vaya seguido por un número suficiente de
codones codificantes hasta llegar a un codón de parada.
Proyecto Genoma Humano:
Individualidad Genética
No hay 2 personas iguales (excepto
gemelos)
Cuando se compara la misma región del
genoma en 2 personas difiere en 0,1%
 son ≈ 3 millones de diferencias en el
genoma.
Variaciones
Los Polimorfismos de un
solo nucleótido (SNPs,
pronunciado como snips)
son secuencias en el
genoma que difieren en un
solo par de nucleótidos
entre una porción de la
población y otra.
(SNP: single nucleotide polymorphisms)
Existen duplicación y deleción de grandes
blocks de DNA. Cuando el genoma de cualquier
persona es comparada con el genoma de
referencia estándar se observa al menos 100
diferencias que involucran grandes blocks de
secuencia. Algunas de estas diferencias son muy
comunes, sin embargo otras estas presentes en
una pequeña minoría de la población.
Una comparación entre dos genomas
encontraron 297 variantes estructurales de
segmentos de tamaño intermedio (8 kilobases):
139 inserciones, 102 deleciones y 56 inversiones.
¿El genoma humano es patentable?
El 11 de Noviembre de 1997, la UNESCO aprobó
la DECLARACIÓN UNIVERSAL SOBRE GENOMA
HUMANO Y LOS DERECHOS DEL HOMBRE,
fijando tres principios:

La dignidad del individuo cualesquiera sean sus
características genéticas.

Rechazo al determinismo genético.

El Genoma Humano es PATRIMONIO DE LA
HUMANIDAD.
Controversias éticas
El conocimiento del genoma humano tiene también
diversas implicaciones éticas, jurídicas y sociales,
estimulando un debate internacional sobre algunos
aspectos:

Patentar secuencias de genes humanos para uso
comercial.

Confidencialidad en la información obtenida, como
por ejemplo, poner la información sobre genética
humana a disposición de empresas de seguros.

La libertad a no saber si se es o no portador de una
enfermedad genética.
EN RESUMEN:
GENOMA HUMANO
Longitud del ADN
Número de genes
3,2x109 pb
Gen mas largo
2,4 x106 pb
 25.000
Tamaño medio de gen
Menor nº de exones /gen
Mayor nº de exones /gen
Nº medio de exones /gen
27.000 pb
1
178
10,4
Tamaño del exón mas largo
17.106 pb
Tamaño medio de exon
Nº de pseudogenes
% de la secuencia del DNA en los exones
(secuencias que codifican proteínas
% de la secuencia del DNA en secuencias
altamente conservadas*
% de DNA elementos altamente repetitivos
*: incluye
145 pb
Mas de 20.000
1,5%
3,5%
 50%
DNa que codifica 5’ y 3’ UTRs (untranslated regions of mRNAs), genes de RNAs estructural y
cataliticos, regiones regulatorias de ADN y regiones conservadas de función desconocidas.
Polimorfismo y Mutación
Cuando la frecuencia alelica, del alelo
más raro es del uno por ciento o
mayor, ese locus se llama locus
polimórfico, y esa variación se
denomina polimorfismo.
 Cuando la variación es menos
frecuente es una mutación, es más
grave y desencadenan una
enfermedad

Human Gene Mutation
Database
(HGMD)

http://www.hgmd.org/
Número Total de
Mutaciones
Splicing
9%
2%
56%
Missense/nonsense
Regulatory
Small deletions
15%
Small insertions
6%
5%
7%
Gross deletions
Repeat variations, Complex
rearrangements
Total: 148.413 mutaciones informadas 24-06-14
Espectro de diferentes tipos de mutaciones en
genes humanos
(Human Gene Mutation Database)
24-6-14
Complex rearrangements
1504
Gross
insertions/duplications
2600
Repeat variations
434
Small indels
2173
Gross deletions
10963
Small insertions
9423
Small deletions
22610
Regulatory
2884
Splicing
13641
 Single base pair substitutions
Missense/nonsense
82176
Mutaciones sin sentido/con cambio de sentido
80%
Missense (Mutaciones con
cambio de sentido)
Nonsense (Mutaciones sin
sentido)
20%
1º
3º
2º
1º
2º
3º
4º
MUTACIONES PUNTUALES
En la región regulatoria
 En el splicing
 Sin sentido (nonsense)
 Con cambio de sentido (missense)

Espectro de diferentes tipos de mutaciones en
genes humanos
(Human Gene Mutation Database)
24-6-14
Complex rearrangements
1504
Gross
insertions/duplications
2600
Repeat variations
434
Small indels
2173
Gross deletions
10963
Small insertions
9423
Small deletions
22610
Regulatory
2884
Splicing
13641
 Single base pair substitutions
Missense/nonsense
82176
Mutaciones sin sentido/con cambio de sentido
DELECIONES DE GENES



Las deleciones son responsables de mas
500 enfermedades hereditarias en
humanos.
Y estas deleciones pueden ser clasificadas
en base a la longitud del ADN
delecionado.
Algunas deleciones consiste de solo unas
pocas pares de bases hasta varias cientos
de kilobases
DELECIONES DE GENES



2,5 a 5% de pacientes con hemofilia A
son debidos a deleciones en el gen F8C
(Factor VIII) con perdida de 26 exones de
un longitud 186 Kb
84% de los pacientes con deficiencia
sulfatasa esteroidal (STS), con perdida de
10 exones de una longitud de 146 kb de
ADN genómico.
Grandes deleciones son comunes en la
distrofia muscular de Duchenne, GH,
RLDL y el gen de 1-globina
PEQUEÑAS
DELECIONES

Existe un total
de 2.368
deleciones de
genes
causantes de
enfermedades
con una
longitud de 20
bp o menos
Estrategias en el laboratorio
de Biología Molecular





Grandes Deleciones
Southern Blotting
GAP-PCR
MAPH and MLPA
Long-range PCR

Mutaciones Puntuales y
deleciones pequeñas

RFLP-PCR(ER-PCR)
Mutagenesis mediada
por PCR
Alelo-Específicas:
MAS-PCR
ARMS- MARMS
DOT-ASO





Estrategias en el laboratorio
de Biología Molecular II

Desconozco la mutación o polimorfismo
SSCP
(single strand conformation polymorphism)
 DGGE
(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

SSCP
 SSCP
(single strand
conformation polymorphism)
es un método simple y
accesible para detectar
alteraciones en la secuencia
en un fragmento obtenido por
PCR
Pasos


Después de la amplificación de cualquier
secuencia de ADN dada, los fragmentos
de ADN amplificados se someten a la
desnaturalización con calor o agentes
químicos, tales como formamida.
Posteriormente, los fragmentos de ADN
desnaturalizados se someten a
electroforesis a través de un gel de
poliacrilamida nativo (no
desnaturalizante).
WT
AA
BB
AB
Inserción 
Delecion 
DGGE (Denaturing Gradient
Gel Electrophoresis)
Los productos de PCR son
cargados en un gel con un
gradiente desnaturalizante
simple complejo
20%
Típicamente 20-80%
formamida
ADN doble cadena migra
hasta encontrar su melting
El melting es determinado
por su secuencia y
contenido de GC
80%
Las diferentes secuencias
migran a diferentes
distancias
• DESNATURALIZACIÓN DEL DNA
1. Composición de bases
2. Longitud DNA doble
3. Presencia de agentes
desnaturalizantes
Agentes desnaturalizantes.
Formamida: Baja la T° de melting a 0,72°C cada 1%
DGGE (Denaturing Gradient
Gel Electrophoresis) II
Ventajas
Puedo cortar las bandas y
secuenciar
Puedo detectar pequeñas
diferencias en la secuencia de DNA
 Desventajas
 Puede haber complejidad en el
chorreado de las muestras
 Requiere una aparatología
específica
Extracción de ADN

Todos los alumnos harán una
extracción de muestra de sangre por
punción venosa.
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