COOPERACION ANVISA / AECI
VALIDACION DE METODOS
CALCULO DE INCERTIDUMBRE
DE MEDIDA
TORO NOZAL M.J., YSA VALLE M.
CENTRO DE INVESTIGACION Y CONTROL DE LA
CALIDAD (C.I.C.C.) - INSTITUTO NACIONAL DEL
CONSUMO
MINISTERIO DE SANIDAD Y CONSUMO
VALIDACIÓN DE MÉTODOS
ISO/IEC 17025:1999 (5.4.5.1)
Confirmación mediante examen y
la aportación de evidencias
objetivas que demuestren el
cumplimiento de ciertos requisitos
para el uso específico previsto
ESTIMACIÓN DE LA
INCERTIDUMBRE DE MEDIDA
ISO/IEC 17025:1999 (5.4.6.2)
Los laboratorios de ensayo
deben disponer y aplicar
procedimientos para estimar la
incertidumbre de medida.
GENERALIDADES
MÉTODOS QUE REQUIEREN ALGÚN TIPO
DE VALIDACIÓN
•MÉTODOS INTERNOS
•MÉTODOS EXTERNOS
MÉTODOS INTERNOS
•
Los desarrollados en el propio laboratorio.
• Deberán ser validados en función del uso que
se vaya a hacer de ellos, definiendo su campo
de aplicación.
• En estos métodos se realizará una nueva
validación (parcial o total) cuando se cambien
las condiciones del mismo.
MÉTODOS EXTERNOS
1
Los desarrollados fuera del
laboratorio y publicados por
organismos oficiales y/o de
reconocido prestigio
(CEN, AENOR, etc.).
MÉTODOS EXTERNOS
2
No requerirán validación cuando
se tiene constancia de que han
sido validados y se dispone de
los correspondientes parámetros
de validación. Es suficiente que
el laboratorio se asegure que el
uso que pretende hacer del
método es compatible con éste
(material, ensayo, precisión, etc..).
MÉTODOS EXTERNOS
3
Cuando un método externo
validado sea modificado para
su uso en el laboratorio, se
dispondrá de un PNT que
recoja las modificaciones y
se evaluarán los parámetros
necesarios para asegurar su
correcta validación.
MÉTODOS EXTERNOS
4
Los métodos validados por
ensayos interlaboratorios en los
que participe el laboratorio se
considerarán como métodos
externos publicados, si se
dispone de los parámetros de
validación del mismo.
MÉTODOS EXTERNOS
5
• Los métodos externos publicados
por organismos oficiales y/o de
reconocido prestigio de los que no
se tenga constancia de su
validación, deberán ser validados
antes de ser utilizados en los
ensayos.
REALIZACIÓN
•Operaciones previas
•Modo operativo
•Parámetros a evaluar
•Materiales empleados en la validación
•Validaciones de M. Cuantitativos
•Métodos semicuantitativos
•Métodos cualitativos
•Métodos de identificación
Operaciones previas
•
•
•
•
•
Nombramiento del responsable (o
responsables) de la validación.
Recopilación de la normativa
aplicable
Elaboración del PNT de ensayo.
Definición de las características
mínimas del método y de los
parámetros analíticos a validar así
como los criterios de aceptación,
en función de los requisitos.
Se Documentará por escrito en el
documento de diseño de la
validación:
La sistemática completa a seguir
en el proceso de validación
•
•
•
•
•
El nº de experimentos necesarios
para obtener los valores de los
parámetros requeridos
Especificar las muestras que se
van a emplear (marca, lote, fecha,
etc,,), la forma de empleo, como
se van a marcar, los M.R. que se
van a utilizar, etc.
Si se emplean datos históricos,
especificar exactamente cuales
son y todos los datos que
permitan su trazabilidad.
Comprobación que los equipos a
utilizar estén calibrados y/o verificados y en perfecto estado de
funcionamiento
Comprobado y Vº. Bº. del R.T.
Modo operativo
• Definir la sistemática de experimentos necesarios
para obtener los valores de los parámetros
requeridos.
• Los parámetros a determinar estarán en función del
uso del método
– Cuantitativo
– Semicuantitativo
– Cualitativo
– Identificativo
• La información relativa al proceso de validación será
anotada en un registro de validación.
Parámetros a evaluar
• Linealidad/Función de respuesta
• Selectividad/Especificidad
• Precisión:
– Repetibilidad
– Reproducibilidad
• Veracidad (Exactitud)
• Límite de cuantificación
• Límite de detección
• Rango o intervalo de trabajo
• Incertidumbre
Parámetros a evaluar
T ip o d e e n s a yo
P a rá m e tro
Id e n tific a c ió n
E s p e c ificid a d /S e le c tivid a d
D e te rm in a c ió n c u a n tita tiv a d e u n
c o m p o n e n te
R a n g o o in te rv a lo d e tra b a jo
F u n c ió n d e re s p u e s ta /L in e a lid a d
S e le c tiv id a d /E s p e cificid a d
P re c is ió n
E xa c titu d
L im ite d e c u a n tific a c ió n
D e te rm in a c ió n s e m ic u a n tita tiv a d e u n
c o m p o n e n te
D e te rm in a c ió n c u a lita tiv a
P re c is ió n
E xa c titu d
F u n c ió n d e re s p u e s ta
S e le c tiv id a d /E s p e cificid a d
E s p e c ificid a d /S e le c tivid a d
L ím ite d e d e te c c ió n
Materiales empleados
en la validación
• Materiales de Referencia Certificados (MCR)
(NIST, LGC, BCR)
• Materiales de Referencia (MR)
• Muestra analizada por otro método
normalizado debidamente evaluado
• Muestras con adiciones de sustancia de
concentración certificada.
MCR
• Se verificará que el material de referencia
viene acompañado de su certificado, en el
que se especifique claramente:
• el método por el que se ha certificado el
material
• el número de participantes en la
certificación
• su periodo de caducidad y/o condiciones
de conservación.
MR
• Materiales obtenidos a partir de “Test de
eficiencia” suministrados por Entidades
Organizadoras del mismo, al que se les asigna
un valor y una incertidumbre (o variabilidad
del valor de referencia).
• Llevan asociado un certificado, pero que no
incluye todos los requisitos de un MCR.
• Se recomienda que el número de laboratorios
que participan en la asignación del valor sea
superior a 10.
MUESTRA ANALIZADA POR
OTRO MÉTODO
NORMALIZADO DEBIDAMENTE EVALUADO
• Según el parámetro de validación, se
realizará el estudio mediante la
comparación de los resultados por
pares de valores de ambos métodos
como datos independientes.
MUESTRAS CON ADICIONES
DE SUSTANCIAS DE
CONCENTRACIÓN CERTIFICADA
• Muestras preparadas en el laboratorio con
muestras de bajo nivel de concentración
del analito a las que se añade una cantidad
conocida de patrón certificado.
Materiales empleados
en la validación
• Todos los valores de referencia tendrán calculada:su
incertidumbre estimada o el intervalo de confianza
conocido y compatible con los requisitos
especificados.
• Los materiales preparados corresponderán a
muestras con matriz representativa del alcance que
tiene el método que se está validando
• Dado que no es posible realizar la validación con
materiles de referencia para absolutamente todas las
matrices analíticas, se procederá a crear grupos de
matrices en los que un material de referencia sea
representativo del grupo, para realizar su validación.
VALIDACIÓN DE
MÉTODOS CUANTITATIVOS
• Aquellos en los que tras la aplicación del
procedimiento analítico a la muestra analizada, se
genera un valor numérico.
• Aplicación:
– Métodos directos
– Métodos que requieren calibración instrumental
Criterios Generales
• Criterios reglamentados
legales o normativos: se
emplearán como criterios de
aceptación.
• Método reglamentado o
normativo y se indica el
procedimiento de validación:
prevalece éste.
• Muestras de validación:
similares a las matrices del
campo de aplicación.
• Tres muestras con valor de
referencia conocido para
validar a tres niveles.
• Al no poder validar la totalidad
de las matrices, definir
familias de matrices en el que
el método se pueda decidir
que se comporta de igual
forma, por evidencias
históricas, bibliografía o el
sentido común.
• Aconsejable calcular, y por
cada nivel, la cantidad del
material a analizar en la
validación. Tener en cuenta la
caducidad, estabilidad, etc..
Rango o intervalo de trabajo
Límites superior e inferior del intervalo en el que se puede
determinar el mensurando con aceptable grado de precisión y
veracidad.
• Límite inferior: el más bajo en el que han comprobado precisión y
exactitud, a no ser que el método deba medir el nivel más bajo
posible o ausencia por lo que será el límite de cuantificación o el
de detección.
• Límite superior: el nivel más alto en el que se ha comprobado la
precisión y la veracidad.
Criterio de aceptación:
• Si existe límite legislado: el rango lo incluirá en el intervalo.
• Si no existe límite legislado: será definido por el uso del
método a los requerimientos de los usos del método.
Linealidad
Capacidad de un método para obtener resultados linealmente
proporcionales al valor del mensurando en la muestra, dentro de
un intervalo determnado.
Se determinará mediante la curva de calibración y se comprobará la
linealidad analizando diferentes concentraciones de patrones de
valor conocido con un mínimo de 5 en el intervalo lineal y al menos
cada patrón por duplicado.
Criterios de aceptación:
• Si coef. de variación de los factores de respuesta de las diferentes
conc. es inferior al 20%: la recta es lineal y pasa por el origen.
• Si (Sm/m)x 100 es inferior al 20%, se considera que la recta es
lineal.
• Si el coeficiente de correlación “r” es superior a 0,99
Precisión
Concordancia entre los resultados de ensayos independientes en
condiciones estipuladas.
El cálculo de la desviación estándar de repetibilidad y de
reproducibilidad se empleará el método descrito en la Norma UNE
82009-2, a los datos generados en los ensayos para el proceso de
validación.
Es recomendable que se realicen un mínimo de 10 análisis en
condiciones de reproducibilidad y cada análisis se hará por
duplicado, al menos.
Repetibilidad
Reproducibilidad
Repetibilidad
Medida de la precisión de un método efectuado en las mismas
condiciones.
Se expresará como “Límite de repetibilidad” “r”, siendo la
diferencia absoluta entre los resultados de dos determinaciones
paralelas efectuadas sobre la misma muestra. Para ser aceptados,
en condiciones de repetibilidad y con un nivel de significación del
2
0,05, la diferencia entre los valores
de los duplicados no puede ser
mayor que el valor de “r”.
“r” al 95% de confianza se calcula: r = 2 x 2 x Sr
Criterio de Aceptación
r  Shx2x 2 x F
Sh = 0,02 x C0,8495 x 0,67 (C expresado en fracciones másicas)
Reproducibilidad
Medida de la precisión de un método efectuado sobre la misma
muestra pero en condiciones diferentes.
Se expresará como “Límite de reproducibilidad” “R”, siendo la
diferencia absoluta entre los resultados de dos determinaciones
realizadas en condiciones de reproducibilidad sobre la misma
muestra.
“R” al 95% de confianza se calcula: R = 2 x 2 x SR
Criterio de Aceptación
R  SHx2x 2 x F
SH = 0,02 x C0,8495 (C expresado en fracciones másicas)
Exactitud/Veracidad
Capacidad de un método analítico para dar resultados lo más
próximos posibles al valor verdadero.
Las muestras empleadas para la validación de la exactitud, serán
preferiblemente MCR.
Cada muestras será analizada al menos 10 veces, en condiciones
de reproducibilidad intralaboratorio, cada vez por duplicado (20
valores)
VR  X
exactitud/veracidad =
x 100
VR
recuperación (%) =
X
VR
x 100
Corrección = VR - X
Criterio de Aceptación
Tabla A.O.A.C.
Indice de Compatibilidad  2
Selectividad
• Grado por el cual un método puede determinar un
analito dentro de una mezcla compleja, sin ser
interferido por otros componentes de la mezcla.
• Las pruebas más utilizadas para determinar la
selectividad son, a modo de ejemplo:
– Método de adiciones
– Comparación de espectros
– Comparación de métodos
Límite de Cuantificación
Menor cantidad de mensurando que puede ser
determinada con aceptable precisión y veracidad
bajo las condiciones experimentales establecidas.
Límite de Cuantificación
• Métodos con calibración instrumental:
– Métodos con el análisis de la señal del blanco
• Sin utilizar la corrección del blanco
• Cuando se utiliza la corrección del blanco
– Método estadístico aplicado a la recta de calibrado
• Regresión sin blanco
• Regresión con blanco
• Métodos sin calibración instrumental
Criterios de Aceptación:
• Con reglamentación específica: LC < al 50% del valor
reglamentado
• Método normalizado y si se indica el valor del LC, deberá
cumplirse con este valor.
Límite de Detección
Menor cantidad de mensurando que puede ser
detectada con aceptable precisión y veracidad bajo
las condiciones experimentales establecidas.
Deberá ser evaluado solamente en los métodos
cualitativos o en los métodos cuantitativos en los
que se evalúa la presencia sin proceder a la
cuantificación.
Criterios de Aceptación:
• Con reglamentación específica: LD < al límite reglamentado
• Método normalizado y si se indica el valor del LD, deberá
cumplirse con este valor.
MÉTODOS
SEMICUANTITATIVOS
• El laboratorio sólo debe demostrar exactitud y
precisión en un punto.
• Este punto de concentración/valor analítico
escogido para cada matriz marcará la expresión
de resultados que será menor que (<) y mayor
que (>).
• Generalmente es un límite reglamentado.
• Los estudios a realizar son los mismos que para un método cuantitativo, excepto la linealidad.
El L.C. Será inferior al valor validado.
MÉTODOS
CUALITATIVOS
Métodos diseñados para detectar muestras positivas
hasta un nivel bajo de presencia del analito
• Selectividad
• Límite de Detección
• Parámetros de calidad de detección del método
–
–
–
–
–
Sensibilidad
Especificidad
Falsos positivos
Falsos negativos
Eficiencia
MÉTODOS
DE IDENTIFICACIÓN
Métodos que se pueden tratar como casos particulares
de métodos cualitativos, en los que se pretende
determinar la identidad de una sustancia o especie
pura, por lo que no se requiere el análisis del Límite de
Detección, sino pruebas de detección (determinación
de falsos negativos, falsos positivos,)
El procedimiento de validación estará basado en el
epígrafe correspondiente a los métodos cualitativos y
serán documentados por los responsables de la
validación, definiendo los parámetros a validar.
CÁLCULO DE LA
INCERTIDUMBRE DE MEDIDA
La Norma ISO 17025 establece la necesidad de calcular o estimar
las incertidumbres en los resultados de ensayos cuantitativos y
calibraciones que se realicen en el laboratorio.
Incertidumbre de una Medida
Estimación de la parte del resultado completo que caracteriza el
intervalo de valores, dentro del cual se encuentra el valor verdadero de la cantidad medida (o mensurando). Ello, una vez efectuadas las correcciones correspondientes a los errores sistemáticos
conocidos. En caso de no corregirse, se incrementará el intervalo
de incertidumbre para incluir el efecto del error sistemático.
COMPONENTES DE LA
INCERTIDUMBRE
La incertidumbre de un resultado comprende normalmente mu-chas
componentes que pueden ser agrupadas en dos categorías en función del
método utilizado para estimar su valor numérico.
Tipo A
Los que son estimadas aplicando métodos estadísticos a una serie
de determinaciones repetidas.
Tipo B
Las que son estimadas por otros medios.
– Estimación basada en la experiencia
– Estimadas a partir del conocimiento de los intervalos máximos de
variación de una magnitud
– Resultados previos
– Medidas de las que se conoce su distribución.
REALIZACIÓN
•
•
•
•
Definición de la magnitud a medir
Lista de Causas
Evaluación de los componentes
Cálculo de la estimación de la Incertidumbre Típica Combinada
(Uc)
• Cálculo de la Incertidumbre Expandida de Medida
• Cálculo por etapas
DEFINICIÓN DE LA
MAGNITUD A MEDIR
Se debe definir cual es la magnitud que medimos y si esta medida
es:
– Medida Directa (ej.: peso)
– Medida Indirecta (ej.: resultado análisis de A.A.)
En este caso se debe definir la fórmula que liguen todas las
magnitudes utilizadas para calcular el resultado final. En caso
contrario deberá ser tratada como una única medida.
LISTA DE CAUSAS
Para cada una de las medidas definidas establecer la lista de
posibles causas de incertidumbre que la afectan, asociadas
con el factor que la determina. A título orientativo:
• Certificado de Calibración (define correcciones e
incertidumbres)
• Exactitud del instrumento de medida (dada por el fabricante)
• Temperatura
• Inestabilidad de la medida
• Estabilidad a Corto Plazo o Repetibilidad ( a veces aportada por
el fabricante)
• Operador
• Otras: Humedad, ruido, no linealidad, etc., la experiencia, etc..
• Ajunste de Recta de Calibrado
EVALUACIÓN DE
LOS COMPONENTES
Para cada una de las causas, evaluar la contribución de su
componente en función de las posibilidades disponibles.
– a) Para medidas repetidas, tratar las componentes como TIPO A
– b) Las componentes de TIPO B (UB) serán estimadas basándose
en el certificado de calibración, la experiencia, recomendaciones
del fabricante, etc..
CÁLCULO DE LA
ESTIMACIÓN DE LA
INCERTIDUMBRE TÍPICA COMBINADA
Si las componentes de la incertidumbre que se han considerado pueden suponerse independientes, la incertidumbre típica
combinada se obtiene realizando la suma cuadrática:
Uc2 = UA2 + Σ UB2
Cuando la medida no se realiza directamente, se tendrá en
cuenta:
– Definir la fórmula que exprese la magnitud de interés en función
de los parámetros relacionados
– Estimar las correcciones e incertidumbres asociadas a cada una
de esos parámetros
– Calcular la incertidumbre típica combinada aplicando la expresión
general de la “Ley de Propagación de las Varianzas”.
CÁLCULO DE LA
INCERTIDUMBRE
EXPANDIDA DE MEDIDA
I = ± k x UC
siendo:
I: Incertidumbre expandida
k: Factor de cobertura (salvo que se especifique otra cosa
k = 2)
UC: Incertidumbre típica combinada
MODELO CAJA NEGRA
En el caso de que no se pueda descomponer la
medida de una serie de medidas intermedias y el
proceso de análisis requiera la realización de múltiples etapas independientes, que imposibiliten la
realización de experimentos adecuados para la
obtención de una estimación del valor de la incertidumbre se podrá optar po el siguiente esquema
de cálculo de incertidumbres:
– Definición de etapas
– Cálculo de la incertidumbre de cada etapa
(desglosada por partes o por “caja negra”)
– Composición como suma cuadrática de la
incertidumbre de cada etapa
– Cálculo de la incertidumbre típica combinada
MODELO CAJA NEGRA
El modelo “caja negra” se basa en suministrar al
método, una muestra con un valor y fiabilidad
(incertidumbre) conocidas.
Del método, por alguna causa no sabemos o no
podemos evaluar sus diversos componentes de
variabilidad interna.
En este caso, se puede conocer la incertidumbre
del método analizando los resultados a la salida,
evaluando su precisión y su exactitud.
MODELO CAJA NEGRA
Valor de referencia
Valor asignado ± incertidumbre
MRC
Ejercicio intercomparación
Adiciones
…
Resultado analítico
Método
(Caja Negra)
Promedio
Desviación estándar
Número de resultados
MODELO CAJA NEGRA
P roceso analítico
CMR
(C aja N egra)
C Lab
(R eferen cia)
(R esu ltad o s)
D esviación
estándar
S esgo
(exactitu d )
P rom edio
(P recisión )
Descargar

Identificación del Lote