Alvaro Codas
Agosto - 2015
VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS
NORMA ISO 17025 “REQUISITOS GENERALES PARA LA COMPETENCIA DE LOS
LABORATORIOS DE ENSAYO Y CALIBRACIÓN”

Contiene todos los requisitos que tienen que
cumplir los laboratorios de ensayo y de
calibración si desean demostrar que poseen un
sistema de gestión, son técnicamente
competentes y son capaces de generar
resultados técnicamente válidos.
NORMA ISO 17025






Se divide en los capítulos:
1 Objetivo y Campo de Aplicación
2 Referencias Normativas
3 Términos y Definiciones (Norma 17000 y del VIM)
4 Requisitos Relativos a la gestión (organización,
sistema de gestión, control d documentos, Revisión de
pedidos, ofertas y contratos, compras de servicios y
suministros, servicio al cliente, Quejas, auditorias
internas etc.)
5 Requisitos Técnicos (personal, instalaciones y
condiciones ambientales, métodos de ensayo y de
calibración y VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS)
VALIDACIÓN

ISO 17025:2005 Confirmación, mediante el
examen y el aporte de evidencias objetivas, de
que se cumplen los requisitos particulares para
un uso específico previsto (5.4.5.2).
ISO 17025 (5.4.5.2)
Validar Métodos No Normalizados
 Métodos desarrollados por el laboratorio
 Métodos Normalizados empleados fuera del
alcance previsto, o modificaciones de los
mismos.

ISO 17025:2005 (NOTA 42)






Es conveniente:
Utilización de patrones de referencia o materiales de
referencia
Comparación de resultados obtenidos con otros
métodos
Comparaciones interlaboratoriales
Evaluación sistemática de los factores que influyan en
el resultado
Evaluación de la incertidumbre de los resultados
basada en el conocimiento científico de los principios
teóricos del método y en la experiencia práctica.
VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS
Procedimiento para establecer por medio de
estudios laboratoriales una base de datos que
demuestren científicamente que un método
analítico tiene las características de desempeño
que son adecuadas para cumplir los
requerimientos de las aplicaciones analíticas
pretendidas.
 Implica la demostración de la determinación de
las fuentes de variabilidad y del error sistemático y
al azar de un procedimiento, no solo dentro de la
calibración sino en el análisis de muestras reales.

VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS
MÉTODO ANALÍTICO: adaptación específica de
una técnica analítica para un propósito de
medición seleccionado.
 PARAMETROS DE DESEMPEÑO ANALITICO:
Características de validación que necesitan ser
evaluadas y típicamente son: exactitud,
precisión, especificidad, límite de detección,
límite de cuantificación, linealidad, intervalo de
linealidad y robustez.

VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS - GUIAS





Guía Q2 International Conference of Harmonisation
(ICH).
Guidelines for the Validation of Chemical Methods for
the FDA Foods Program (Food and Drug Administration)
AOAC INTERNATIONAL Guidelines for Validation of
Botanical Identification Methods
HARMONIZED GUIDELINES FOR SINGLELABORATORY
VALIDATION OF METHODS OF ANALYSIS (IUPAC)
Validation of Compendial Methods – Verification of
Compendial Methods (USP)
CONCEPTOS ESTADÍSTICOS
Medidas de Tendencia Central
1. Media
2. Mediana
3. Moda
 Medidas de Variación
1. Rango
2. Varianza
3. Desviación Estándar (y desviación estándar
relativa o %RSD)

MEDIDAS DE TENDENCIA CENTRAL
MEDIA: es la suma de todos los valores dividido
por el número de valores.
Para una muestra:
Para una muestra:
Donde (X) representa la Media para la muestra,
(n) el tamaño de la muestra y (Xi) representa
cada uno de los valores observados.

MEDIDAS DE TENDENCIA CENTRAL

MEDIANA: Con esta medida podemos
identificar el valor que se encuentra en el
centro de los datos, es decir, nos permite
conocer el valor que se encuentra exactamente
en la mitad del conjunto de datos después que
las observaciones se han ubicado en serie
ordenada.
MEDIDAS DE TENDENCIA CENTRAL
MODA: La medida modal nos indica el valor que
más veces se repite dentro de los datos.
Ej: si tenemos la serie ordenada (2, 2, 5 y 7), el valor
que más veces se repite es el número 2 quien seria
la moda de los datos.
 Es posible que en algunas ocasiones
se presente dos valores con la mayor frecuencia,
lo cual se denomina Bimodal o en otros casos más
de dos valores, lo que se conoce
como multimodal.

ERROR





ERROR SISTEMÁTICO: Como su nombre indica, no son debidos al
azar o a causas no controlables. Pueden surgir de emplear un
método inadecuado, un instrumento defectuoso o bien por usarlo en
condiciones para las que no estaba previsto su uso.
Las causas pueden ser la siguientes:
Errores instrumentales (de aparatos).
Error personal. Este es, en general, difícil de determinar y es debido
a limitaciones de carácter personal. Un ejemplo de éste sería una
persona con un problema de tipo visual.
Error de la elección del método. Corresponde a una elección
inadecuada del método de medida de la magnitud. Este tipo de
error puede ponerse de manifiesto cambiando el aparato de
medida, el observador, o el método de medida.
ERROR

ERROR ALEATORIO (ACCIDENTAL): Son
incertidumbres debidas a numerosas causas
incontrolables e imprevisibles que dan lugar a
resultados distintos cuando se repite la medida
en condiciones idénticas. Son errores debidos
al azar. Aunque la presencia de los errores
accidentales no pueda evitarse, sí puede
estimarse su magnitud por medio de métodos
estadísticos.
MEDIDAS DE VARIACIÓN


RANGO: es la diferencia entre el mayor valor y el
menor valor del grupo de muestras.
DESVIACIÓN ESTÁNDAR: es la raíz cuadrada de la
varianza. A su vez, la varianza equivale al promedio de
las desviaciones o diferencias cuadráticas de cada
valor de una serie con respecto al promedio de esa
serie. En un conjunto de datos es una medida de
dispersión, que nos indica cuánto pueden alejarse los
valores respecto al promedio (media).
MEDIDAS DE VARIACIÓN
DESVIACIÓN ESTÁNDAR RELATIVA (%RSD)
 Desviación estándar relativa (RSD) se calcula
al dividir la desviación estándar entre el
promedio de la serie de datos.
 RSD se expresa en partes por mil (ppmil) o en
porcentaje, multiplicando esta relación por
1000 o por 100, respectivamente.

CALCULOS ESTADISTICOS

PRUEBA F de SNEDECOR-FISHER (Análisis de
Varianzas): Es una distribución de probabilidad de
gran aplicación en la inferencia estadística,
fundamentalmente en la contrastación de la
igualdad de varianzas de dos poblaciones
normales, y, fundamentalmente en el análisis de
varianzas, técnica que permite detectar la
existencia o no de diferencias significativas entre
muestras diferentes y que es, por tanto esencial,
en todos aquellos casos en los que se quiere
investigar la relevancia de un factor en el
desarrollo y naturaleza de una característica.
PRUEBA F DE SNEDECOR-FISHER
Es una prueba estadística empleada para la
comparación de varianzas.
 Sean 2 conjuntos de datos:

Consideramos la hipótesis nula que dice que
las varianzas no presentan diferencias
significativas entre sí.
 Y se compara con Ftab(0,05)

PRUEBA F DE SNEDECOR-FISHER

Si F<Ftab admitimos H0
HERRAMIENTAS DE CALCULO

Minitab

Excel
VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS DEFINICIONES




ESPECIFICIDAD: Habilidad de evaluar inequívocamente el analito en presencia de
componentes que se puede esperar que estén presentes. Típicamente éstos pueden incluir
impurezas, productos de degradación, la matriz, etc.
EXACTITUD: (VERACIDAD): Expresa la cercanía entre el valor que es aceptado, sea como un
valor convencional verdadero (material de referencia interno de la firma), sea como un valor de
referencia aceptado (material de referencia certificado o estándar de una farmacopea) y el
valor encontrado (valor promedio) obtenido al aplicar el procedimiento de análisis un cierto
número de veces.
INTERVALO DE LINEALIDAD: Ámbito entre la menor y la mayor concentración de analito en la
muestra (incluyendo éstas concentraciones) para las cuales se ha demostrado que el
procedimiento analítico tiene el nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad.
LIMITE DE CUANTIFICACION: Cantidad más pequeña del analito en una muestra que puede ser
cuantitativamente determinada con exactitud aceptable. Es un parámetro del análisis
cuantitativo para niveles bajos de compuestos en matrices de muestra y se usa
particularmente para impurezas y productos de degradación. Se expresa como concentración
del analito.
VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS DEFINICIONES





LIMITE DE DETECCION: Cantidad más pequeña de analito en una muestra que
puede ser detectada por una única medición, con un nivel de confianza
determinado, pero no necesariamente cuantificada con un valor exacto. Es
comúnmente expresado como concentración del analito.
LINEALIDAD: Habilidad (dentro de un ámbito dado) del procedimiento analítico de
obtener resultados de prueba que sean directamente proporcionales a la
concentración de analito en la muestra.
MATERIAL DE REFERENCIA (PATRÓN TERCIARIO): Material o sustancia, en el cual
una o más de sus propiedades están suficientemente bien establecidas para que
sea usado en la calibración de un aparato, la estimación de un método de medición
o para asignar valores a los materiales.
MATERIAL DE REFERENCIA CERTIFICADO (PATRÓN SECUNDARIO): Material en el que
los valores de una o más de sus propiedades están certificados por un
procedimiento técnicamente validado, bien sea que este acompañado de, o pueda
obtenerse, un certificado u otra documentación emitida por un ente certificador.
MATERIAL ESTANDAR DE REFERENCIA (PATRÓN PRIMARIO): Material emitido por la
Oficina Nacional de Normas de Estados Unidos (U.S National Bureau of Standars)
cuyo nombre fue cambiado recientemente a Instituto Nacional para Normas y
Tecnología (National Institute for Standards and Technology, NIST.)
VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS DEFINICIONES






PRECISION: expresa la cercanía de coincidencia (grado de dispersión) entre una serie de mediciones
obtenidas de múltiples muestreos de una misma muestra homogénea bajo condiciones establecidas.
Puede considerarse a tres niveles: repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad. Debe
determinarse utilizando muestras originales y homogéneas. Sin embargo, si no es posible obtener
una muestra homogénea puede ser determinada usando muestras preparadas o una disolución de
la muestra.
PRECISION INTERMEDIA: Precisión obtenida dentro del laboratorio por diferentes analistas,
diferentes equipos, días distintos con la misma muestra homogénea.
PROCEDIMIENTO ANALITICO: Forma en que se realiza el análisis. Debe describir en detalle los pasos
necesarios para realizar cada prueba analítica. Puede incluir, pero no necesariamente los siguientes
conocimientos: características de la muestra, preparación de los estándares de referencia y
reactivos, uso de los aparatos o instrumentos, generación de la curva de calibración, uso de fórmulas
para los cálculos.
PROCEDIMIENTO ANALITICO OFICIAL: Procedimiento analítico estandarizado contenido en una
farmacopea oficial o libros oficiales. Se les supone validados y los laboratorios que los utilizan no
están obligados a validar la exactitud de los mismos, solamente demostrar su aptitud para aplicarlos,
validando la linealidad y precisión del sistema.
REPETIBILIDAD (REPETITIVIDAD): Precisión obtenida bajo las mismas condiciones de operación en un
intervalo corto de tiempo (mismo día), por un mismo analista, en la misma muestra homogénea y en
el mismo equipo.
REPRODUCIBILIDAD: Expresa la precisión entre laboratorios como resultado de estudios
interlaboratoriales diseñados para estandarizar la metodología.
VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS DEFINICIONES







ROBUSTEZ: Medida de la capacidad de un procedimiento analítico de permanecer inafectado por
pequeñas pero deliberadas variaciones en los parámetros del método y provee una indicación de su
fiabilidad en condiciones de uso normales.
SELECTIVIDAD: Describe la habilidad de un procedimiento analítico para diferenciar entre varias
sustancias en la muestra y es aplicable a métodos en los que dos o más componentes separados y
cuantificados en una matriz compleja.
SESGO: Se usa en el sentido de exactitud de un promedio a largo plazo (valor esperado) de una serie
de promedios. Es la diferencia en el valor esperado (teóricamente igual al promedio de un número
infinito de valores individuales independientes) del valor verdadero, correcto o asumido.
SISTEMA ANALITICO: Está compuesto por: equipos, reactivos, materiales, documentos, patrones,
materiales de referencia, analistas y variables operativas, que se utilizan en un método de análisis.
TECNICA ANALITICA: Principio científico que se ha encontrado útil para proveer información sobre la
composición de un determinado producto o material
VALIDACIÓN: Confirmación que se da por la recopilación y análisis de la evidencia objetiva de que se
cumplen los requisitos particulares para el uso específico propuesto.
VALIDACIÓN DE UN PROCEDIMIENTO ANALITICO: Procedimiento para establecer por medio de
estudios laboratoriales una base de datos que demuestren científicamente que un método analítico
tiene las características de desempeño que son adecuadas para cumplir los requerimientos de las
aplicaciones analíticas pretendidas. Implica la demostración de la determinación de las fuentes de
variabilidad y del error sistemático y al azar de un procedimiento, no solo dentro de la calibración
sino en el análisis de muestras reales.
PROTOCOLO DE VALIDACION












Objetivos
Alcance
Referencias bibliográficas
Factores Críticos
Responsabilidades
Datos de la muestra a ser utilizada (matriz)
Analitos a ser ensayados
Información del estándar
Fechas
Descripción de los parámetros a ser evaluados
Equipos, materiales y reactivos
Verificaciones Previas
VALIDACION DE MÉTODOS ANALÍTICOS EVOLUCIÓN
VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS DEFINICIONES
VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS
CUANTITATIVOS

•
•
•
•
•
•
Los métodos cuantitativos de análisis exigen, para su
validación, que se determine la siguiente serie de
parámetros que han de cumplirse:
Especificidad/selectividad
Límite de detección
Precisión (en condiciones de repetibilidad y/o
reproducibilidad en laboratorio)
Linealidad y rango de trabajo
Exactitud (en condiciones de repetibilidad y/o
reproducibilidad en laboratorio o Recuperación
Incertidumbre de la medición
EXACTITUD

Comparación con un método oficial, validado o
estandarizado: La muestra debe ser analizada,
utilizando el método a validar y un segundo
método bien caracterizado, el cual debe tener una
exactitud bien definida y establecida. Criterio de
aceptación: Se lleva a cabo un análisis de varianza
(ANOVA), del porcentaje de recuperación o del
error relativo en porcentaje, para determinar si hay
o no diferencia significativa entre la exactitud de
los métodos comparados.
EXACTITUD
2.
a.
b.
Adición Estándar:
Con Placebo: Se utiliza una mezcla preparada en el
laboratorio de todos los componentes de la matriz de la
muestra sin el principio activo a determinar, luego el
placebo se enriquece con estándar.
Con Muestra: Cuando no es posible contar con un placebo,
se determina por triplicado el contenido promedio del
analito en la muestra con el método a validar; una vez
conocido el contenido promedio se procede a enriquecer
las muestras con estándar. Para preparar las soluciones,
en este caso se mantiene constante la cantidad de
muestra tomada y se agregan cantidades variables del
estándar.
EXACTITUD

Cuando se aplica
a un método de
ensayo, el termino
“exactitud” se
refiere a una
combinación de
veracidad y
precisión.
EXACTITUD
Los criterios de aceptación:
1. Placebo enriquecido: 98% - 102%
2. Muestra enriquecida:
a. Sobre 100 ppb (ng/L) 80%-100% de
recuperación
b. Menos de 100 ppb (ng/L ) 60%-110 % de
recuperación
c. Menos 1 ppb 70%-120% de recuperación

EXACTITUD
3.
Comparación de las curvas de regresión lineal de
estándares con curvas de regresión lineal de
placebos enriquecidos (métodos de curvas de
respuesta relativa): Se preparan soluciones a
diferentes niveles de concentración de placebo
enriquecido ( 80, 100, 120%) y soluciones de
estándares a los mismos niveles de
concentración. Separadamente se evalúa la
regresión lineal de ambos grupos y se lleva a
cabo la comparación de las pendientes y los
interceptos.
EXACTITUD

Comparación de los resultados obtenidos de un
estándar o material de referencia certificado: Se
analiza por replicado el material, por el método a
validar y se compara el resultado obtenido con el
valor verdadero declarado, este método se
encuentra limitado por la disponibilidad y la
estabilidad del material de referencia, así como
por el grado de incertidumbre que se tenga del
valor verdadero de la concentración del material
de referencia.
PRECISIÓN
Existen diferentes maneras de determinar la
precisión:
a. Repetibilidad
b. Precisión Intermedia
c. Reproducibilidad
 En términos generales la precisión, debe
determinarse, analizando un número suficiente de
alícuotas, que permitan calcular estadísticamente
la desviación estándar y la desviación estándar
relativa (%RSD).

REPETIBILIDAD
Refiere al mismo analista, mismo equipo,
mismos materiales en el mismo día
Equipo o instrumento: evalúa el desempeño del
sistema independientemente de la muestra a
analizar.
El método: evalúa el desempeño del método
sobre las muestras analizadas en las mismas
condiciones.

REPETIBILIDAD
Media
SD
%RSD
Repetibilidad
Area
Concentracion
1
2522348
1,14
2
2370955
1,08
3
2274833
1,03
4
2384483
1,08
5
2405505
1,09
2391625
1
88599,92
0,04
3,7
3,6
Criterio de aceptación: El
método y el sistema
propuestos cumplen con el
ensayo de repetibilidad si
cumplen con el valor de RSD.
El valor de RSD depende de
las concentraciones que se
van a analizar. Ej.: si se va a
determinar un analito cuya
concentración es inferior a
10ppb el valor de RSD ≤ 20%
REPRODUCIBILIDAD (PRECISIÓN INTERMEDIA)

Media
SD
%RSD
Precisión intermedia
Area
Concentracion
1
2481590
1,13
2
2507384
1,14

3
2405969
1,09
4
2385713
1,08
5
2362925
1,07
2428716
1
62608,81
0,03
2,6
2,8
Refiere a otro analista,
en un equipo diferente,
en un día diferente.
(Entre laboratorios)
Precisión Intermedia:
se analizan las
muestras de igual
manera que en la
repetibilidad pero con
un analista diferente
en un día diferente.
PRECISIÓN
Al tener los datos de Repetibilidad y
Reproducibilidad o Precisión Intermedia, se
aplica un análisis de varianza “Prueba F de
Fisher”
 Lo ideal es realizar con dos o más
concentraciones dentro del rango establecido.

PRECISIÓN
EJEMPLO
LINEALIDAD E INTERVALO (SENSIBILIDAD)

El comportamiento lineal de un método, debe
ser demostrado dentro del intervalo (rango) en
el cual es probable que se trabaje. Este
intervalo varía dependiendo del tipo de
determinación a realizar. Por esta razón se
establece los intervalos dentro de los cuales
deben llevarse a cabo las pruebas para cada
análisis. La determinación del intervalo o rango
deriva del estudio de la linealidad
LINEALIDAD E INTERVALO DEL SISTEMA
1.
2.
3.
4.
5.
Preparar en forma independiente soluciones de estándar al
menos 5 niveles de concentración, las cuales deben
encontrarse dentro de los intervalos establecidos para
cada tipo de análisis.
Este procedimiento debe repetirse en forma independiente
por lo menos 3 veces, para evaluar estadísticamente la
regresión lineal del sistema.
Con éstos datos se grafica la respuesta de la medición,
contra la concentración del analito. Se verifican datos con
comportamiento atípico mediante mediciones adicionales.
Realizar un análisis de varianza de la regresión lineal
Calcular el coeficiente de regresión.
LINEALIDAD E INTERVALO DEL MÉTODO
1.
2.
3.
4.
5.
Preparar soluciones de muestra o placebo enriquecidos a
cinco niveles de concentración, los cuales deben
encontrarse dentro de los intervalos establecidos.
Este procedimiento debe repetirse en forma independiente
por lo menos 3 veces, para evaluar estadísticamente la
regresión lineal del método.
Con estos datos se grafica la respuesta de la medición,
contra la concentración del analito. Se verifican datos con
comportamiento atípico mediante mediciones adicionales.
Realizar un análisis de varianza de la regresión lineal.
Calcular el coeficiente de regresión con la totalidad de los
datos.
LINEALIDAD E INTEVALO
CRITERIOS DE ACEPTACIÓN:
1. El coeficiente de correlación de la regresión
lineal debe encontrarse entre 0.98 y 1.00, el
coeficiente de correlación al cuadrado debe
ser mayor de 0.995
2. Se considera que la mejor manera de indicar
la linealidad es por una prueba de t de
Student.
r√(n-2)
tr=
√(1-r2)

LINEALIDAD E INTEVALO
CRITERIOS DE ACEPTACIÓN
 Distribución Normal de los residuos:
 H0: los datos siguen una distribución normal
 H1: los datos no siguen una distribución
normal.
 Se acepta H0 si p-value (valor de p) es <0,05
 P-value (valor de p): probabilidad de cometer
un error del tipo 1

PRECISIÓN
EJEMPLO
LIMITE DE DETECCIÓN

1.
Puede ser establecido de diferentes maneras
dependiendo del tipo de método.
Métodos no instrumentales: El límite de
detección se determina por medio del análisis
comparativo de un blanco y de muestras
independientes de blanco enriquecido con
diferentes niveles de concentraciones conocidas
del analito. Se compara el comportamiento de las
muestras con el blanco y se establece el nivel
mínimo al cual el analito puede ser realmente
detectado
LIMITE DE DETECCIÓN
2.
a.



Métodos Instrumentales:
Por comparación de blanco y blanco enriquecido a una sola
concentración: Se utiliza cuando la desviación estándar del
blanco es diferente de 0. Se preparan no menos de 10
blancos independientes y 10 blancos enriquecidos a la
concentración más baja aceptada. Una vez preparadas las
soluciones, se llevan a cabo las mediciones de cada una y
posteriormente se calcula la desviación estándar de cada
grupo de datos.
Con estos datos se puede calcular el límite de detección
LD= Valor promedio del blanco + 3S
Donde S es la desviación estándar de la muestra
enriquecida
LIMITE DE DETECCIÓN
b.

Blanco enriquecido a una concentración: En este caso
se analizan y cuantifican no menos de 10 soluciones
de blanco enriquecidas o muestras enriquecidas
preparadas a la concentración menor para la que se
puede obtener un grado aceptable de incertidumbre.
Se lleva a cabo la cuantificación para cada una de las
soluciones, se calcula el valor promedio de las
concentraciones obtenidas y la desviación estándar.
LD= Concentración promedio obtenida para el blanco o
la muestra enriquecida + 4.65 S
LIMITE DE DETECCIÓN


Método de comparación Señal / Ruido: En el caso de
procedimientos analíticos instrumentales que están sujetos
a ruido de fondo, los documentos de la International
Conference Harmonization describen una aproximación
común que consiste en comparar las señales de muestras
con concentraciones bajas (conocidas) del analito, contra
las señales del blanco. Se preparan muestras de
concentración baja conocida a diferentes niveles de
concentración, de acuerdo con el método en estudio. Se
prepara un blanco, y se miden las señales de las soluciones
preparadas.
El Límite de detección corresponde a la concentración
mínima a la cual el analito es detectado con una relación
señal ruido de 2:1 o 3:1
Considerando un número suficiente de medidas de señal de fondo, se
puede calcular que una señal es significativamente distinta del ruido,
con 95% de probabilidad cuando su valor es 2 veces superior al
intervalo de ruido. Cuando se incrementa la probabilidad hasta un 99%
la señal debe ser al menos 2,65 veces superior al ruido para ser
significativamente distinta.
EJEMPLO DE CALCULO DE LOD Y LOQ
ESPECIFICIDAD

La especificidad puede verificarse de diferentes
maneras, dependiendo del tipo de análisis a
realizar. Es importante tomar en cuenta, que en
aquellos casos en que la matriz de la muestra es
variable, tanto en términos de su composición
(productos biológicos o de origen natural), así
como en la fuente de las materias primas que las
componen (diferentes proveedores, diferentes
orígenes), se recomienda que la especificidad se
establezca para las diferentes composiciones o
fuentes en forma independiente.
ESPECIFICIDAD
Comparación del comportamiento de la matriz o
impurezas con respecto al comportamiento del
estándar: [C]estándar = [C]Matriz (La matriz no
debe presentar ningún tipo de señal que interfiera
con la señal que se para el estándar.)
 Comparación del comportamiento de muestra con
respecto al comportamiento del estándar:
[C]estándar = [C]Muestra (La muestra no debe
presentar ningún tipo de señal que interfiera con
la señal que se encuentra para el estándar)

ESPECIFICIDAD
No siempre es posible demostrar que un
procedimiento analítico es específico para un
analito en particular (Combinación de dos o
más procedimientos).
 Identificación:
a. Materiales de Referencia
b. Muestras que contengan el analito y placebos

ESPECIFICIDAD -IMPUREZAS
Impurezas Disponibles: Fortificados de las
impurezas dentro de la muestra. Demostrar
que los resultados del ensayo no sean
afectados por la presencia de éstas.
 Impurezas no Disponibles: Degradación del
producto bajo condiciones de estrés (luz, calor,
humedad, ácido/base, hidrólisis y oxidación)

INCERTIDUMBRE

“Parámetro positivo, asociado al resultado de
una medición, que caracteriza la dispersión de
los valores que pudieran ser razonablemente
atribuibles al mensurando, basada en la
información usada”
INCERTIDUMBRE
La incertidumbre de las mediciones, por lo
general, tiene muchos componentes.
 Se calcula estimando los errores que se
producen en las distintas etapas del análisis,
por ejemplo, la etapa preanalítica, la
homogeneización, el pesaje, el pipeteado, la
inyección, la extracción, la derivación, la
recuperación y las curvas de calibración.

INCERTIDUMBRE
INCERTIDUMBRE
Incertidumbre estándar (up): desviación
estándar de la medición de la validación.
 Incertidumbre combinada (uc): combinación de
las incertidumbres.
 Incertidumbre expandida (U): multiplicar la
incertidumbre combinada por un factor de
cobertura de k = 2, a fin de entregar un 95%
de confianza, y así establecer el intervalo
entorno al resultado de la medición.

INCERTIDUMBRE
EJEMPLO
ROBUSTEZ
Ensayo de robustez: para estudiar el
comportamiento de un procedimiento analítico
cuando se hacen pequeños cambios en las
condiciones ambientales y/o de operación.
Involucra variaciones deliberadas en el
método.
 Permite identificar aquellas variables que
provocarán cambios significativos y que
deberían ser controladas más estrictamente

ROBUSTEZ
La evaluación de la robustez debe ser
considerada durante la etapa de desarrollo del
procedimiento analítico.
 Debe demostrar la confiabilidad de un análisis
con respecto a variaciones deliberadas en los
parámetros del método evaluado.

ROBUSTEZ
Variaciones típicas
a) Estabilidad de las soluciones
b) Tiempo de extracción
c) En LC (pH y composición de la FM, columnas,
Tº, flujo, etc)
d) En GC (Columnas, temperatura, flujo,etc.)

ROBUSTEZ
x-X < (√2)SD
ROBUSTEZ
ROBUSTEZ
RESUMEN
VALIDACIÓN-CROMATOGRAFIA
Ensayo: Cuantificación de Enalapril maleato en
comprimidos
 Parámetros ensayados: Linealidad (r2>0,995),
Precisión del sistema (%RSD<2%) y del
método(%RSD<7%), Exactitud (90-110%).

ENALAPRIL - LINEALIDAD
Rango: 150 a 250 µg/mL
Niveles: 7
Pendiente: 19661
Intercepto: 100379
r2= 0,9992
ENALAPRIL - EXACTITUD
Ensayos: 9
Niveles: 3 (40, 50 y 60 mg)
Placebo fortificado con
cantidades conocidas de
estándar de trabajo
ENALAPRIL - ESPECIFICIDAD
Se realizaron estudios de degradación acelerada
en los comprimidos.
 Degradación hidrolítica y oxidativa: 3 muestras, 1
con HCl 0,1N, otra con NaOH 0,01N y otra con
H2O2 al 1% y fueron analizadas. Luego a las
mismas muestras se las trató con calor a baño
María a 60ºC durante 2 horas.
 Degradación Térmica: se llevó las muestras a una
temperatura de 80ºC durante 24 horas.
 Degradación Fotolítica: Se expuso las muestras
bajo una lu (1900lux) durante 24 horas

ENALAPRIL - ESPECIFICIDAD
Se analizaron las muestras y se determinó la pureza del pico.(PDA; MS)
ENALAPRIL – ADECUACIÓN DEL SISTEMA

Se realizaron inyecciones de soluciones
estándar y se determinaron el tailing y la
eficiencia de la columna (HETP).
DETERMINACIÓN DE PROTEINAS POR METODO
KJELDAHL
VALIDACIÓN DETERMINACIÓN DE PROTEINAS EN
GRANOS DE SOJA POR EL MÉTODO DE HJELDAHL
Material de Referencia: Sulfato doble de hierro
y amonio (sal de Mohr).
(NH4)2Fe(II)(SO4)2*6H2O  7,145% de
Nitrógeno.
 Se realizó una serie de 10 determinaciones,
por diferentes analistas.

TABLA DE RESULTADOS-1
TABLA DE RESULTADOS-2
RECUPERACIÓN (EXACTITUD)
Experimental: se hicieron 10 repeticiones de la
muestra del material de referencia con (7,145%N),
trabajando con 0,5g de muestra.
 Resultados:

X = 7,150%; S = 0,026
t calculada = 0,61
Recuperación = 100,07%
t tabla = 2,26 P = 95%
t calc < t tabla; los datos pertenecen a la misma población de valores
como el valor de referencia
 Criterio de Aceptación:
Recuperación = 80% - 120%; para concentraciones ≥ 10mg/kg
PRECISIÓN
Experimental: se hicieron 10 repeticiones de la
muestra del material de referencia con
(7,145%N), trabajando con 0,5g de muestra.
 Resultados:
X = 7,150%
S = 0,026
CV(RSD) = 0,36%
Criterio de Aceptación: CV(RSD) ≤ 10%

REPETIBILIDAD
Experimental: se hicieron 3 series de 10
repeticiones del material de referencia
(7,145%N), hecho por un solo analista, en
intervalos de tiempo cortos, usando el mismo
equipo y el mismo método de trabajo.
 Cantidades de Trabajo: 0,3g – 0,5g – 0,7g

REPETIBILIDAD

Resultados:
Muestra 0,3g Muestra 0,5g Muestra 0,7g
X
7,146
7,150
7,155
S
0,013
0,026
0,015
0,182%
0,364%
0,210%
CV(RSD)%

Criterio de Aceptación: CV(RSD) ≤ 10%
REPRODUCIBILIDAD INTERNA (PRECISIÓN
INTERMEDIA)
Experimental: se hicieron 3 series de 10
repeticiones del material de referencia
(7,145%N), realizado por dos analistas,
utilizando equipos, materiales de vidrio, y
reactivos diferentes pero el mismo método.
 La cantidad de muestra utilizada fue de 0,5g
para todas las series.

REPRODUCIBILIDAD INTERNA (PRECISIÓN
INTERMEDIA)


Resultados:
Analista I
Analista II
X
7,150
7,147
S
0,026
0,029
CV(RSD)%
0,364%
0,406%
Criterio de Aceptación: CV(RSD) ≤ 10%
LINEALIDAD (SENSIBILIDAD)

Se hicieron 10 puntos a partir del material de
referencia de 0,1g a 1,0g.
Gramos de Muestra
mgN
0,1
6,938
0,2
14,288
0,3
20,989
0,4
28,598
0,5
34,734
0,6
41,819
0,7
49,860
0,8
57,026
0,9
63,211
1,0
70,259
LINEALIDAD (SENSIBILIDAD)

Resultados:
Chart Title
80,000
y = 7050.9x - 8
R² = 0.9996
70,000
60,000
mgN
50,000
40,000
Series1
Linear (Series1)
30,000
20,000
10,000
0
0
2
4
6
8
Gramos de muestra
10
12
LINEALIDAD (SENSIBILIDAD)

Prueba t de Student: Se desea probar si existe
entonces una correlación significativa: La
hipótesis nula H0 es que no existe correlación
entre X e Y. Si el valor observado de tr es mayor
que tcri, se rechaza la hipótesis nula H0, siendo
la correlación lineal significativa con la
probabilidad calculada.
Tcri = 2.306
Tr = 141,39
Tr > Tcri
Se observa que el valor observado de tr (es decir el
t calculado) es mayor que tcrit (141,39 > 2,306),
por lo cual se rechaza la hipotesis nula Ho, siendo
la correlacion lineal significativa con la
probabilidad calculada.
LINEALIDAD (SENSIBILIDAD)
Criterio de Aceptación:
• El valor de la pendiente debe ser constante.
• a: debe tender a 0.
• R: el coeficiente de correlación debe tender a 1.
• Tr > Tcri
LIMITE DE DETECCIÓN Y LIMITE DE
CUANTIFICACIÓN

Experimental: Se hicieron 10 análisis del
material de referencia, trabajando a 0,0013g
para una concentración de 0,1mgN (Se trabaja
sobre la mínima concentración en la que puede
trabajar el equipo).
LIMITE DE DETECCIÓN Y LIMITE DE
CUANTIFICACIÓN
Resultados:
X = 0,111 mgN

S = 0,002
LOD = 3*0,002 + 0,111 = 0,117 mgN
LOQ = 10*0,002 + 0,111 = 0,131 mgN
 Criterio de Aceptación: LOQ > LOD
MUCHAS GRACIAS
POR SU ATENCIÓN
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