UASLP
Facultad de Medicina
Desarrollo de Herramientas Moleculares
e Informáticas para la Identificación de
Mutaciones Asociadas a
Farmacorresistencia en HIV-1.
Laboratorio de Genómica
Viral y Humana, UASLP
1
Taxonomía
• Virus de RNA monocatenario.
• Género Lentivirus, familia Retroviridae
• Grupo VI clasificación de Baltimore
2
Taxonomía
• Virus de RNA monocatenario.
• Género Lentivirus, familia Retroviridae
• Grupo VI clasificación de Baltimore
• HIV-1 parecido al SIV cpz
-
Grupo M - Main
Grupo O - Outlier
Grupo N – Non-M/O
• HIV-2 parecido a SIVsmm
(mangabeye gris).
3
Impacto Mundial
Estadísticas 2008
•33.4 (31.1-35.8) millones
de infectados por HIV a
nivel mundial.
•2.7 millones de nuevas
infecciones.
•2 millones de
defunciones asociadas.
4
Impacto Nacional
5
Genómica
• Genoma total de 9,719 bp.
• Tres regiones génicas principales:
– gag – 1502 bp (p17, p24, p7).
– pol – 3011 bp (PR, RT, IN).
– env – 2750 bp (gp120, gp41).
• Nueve genes: gag, pol, env, tat, rev, nef, vif, vpr, y vpu.
• Codificantes para 19 proteínas.
• Empleando las tres fases o marcos de lectura disponibles.
6
Mutaciones de Resistencia
10, 11, 16, 20, 24, 30, 32, 33, 34, 36, 43, 46, 47, 48, 50, 53, 54, 58, 60, 62, 63, 64, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 82, 83, 84, 85, 88, 89, 90,
93
Proteasa
41, 62, 65, 67, 70, 74, 75, 77, 90, 98, 100, 101, 103, 106, 108, 115, 116, 138, 151, 179, 181, 184, 188, 190, 210, 215, 219, 225, 230.
RT
92, 143, 148, 155
Integrasa
7
Proteasa
Modelo cristalográfico de un dímero de proteasa de HIV-1
ilustrando los dominios en presencia de Saquinavir (SQV).
Flap
PDB: 3OXC
Resolution: 1.16 Å
Unit Cell:
Length [Å]
a = 52.10
b = 59.78
c = 62.49
Angles [°]
α = 90.00
β = 90.00
γ = 90.00
Coro
Terminal
8
Proteasa
Mapeo de mutaciones mayores y menores descritas en última
publicación (International AIDS Society 2010).
PDB: 3OXC
Resolution: 1.16 Å
Unit Cell:
Length [Å]
a = 52.10
b = 59.78
c = 62.49
Angles [°]
α = 90.00
β = 90.00
γ = 90.00
Mutaciones mayores, mutaciones menores.
9
Transcriptasa Inversa
Modelo cristalográfico de una holoenzima de Transcriptasa inversa de
HIV-1 ilustrando los dominios de p66, p51 y el inhibidor lervisirina.
PDB: 2WON
Resolution: 2.80 Å
Lervisirina
Dedos
Pulgar
Palma
Unit Cell:
Conector
RNasa H
Length [Å]
a = 117.49
b = 154.25
c = 154.88
Angles [°]
α = 90.00
β = 90.00
γ = 90.00
p51
10
Transcriptasa Inversa
Mapeo de mutaciones asociadas a resistencia a NRTI’s y NNRTI’s
descritas en última publicación (International AIDS Society 2010).
Lervisirina
PDB: 2WON
Resolution: 2.80 Å
Unit Cell:
Length [Å]
a = 117.49
b = 154.25
c = 154.88
Angles [°]
α = 90.00
β = 90.00
γ = 90.00
Mutaciones de resistencia a NRTI y a NNRI.
11
Integrasa
Modelo cristalográfico de un dímero de integrasa de HIV-1
ilustrando los dominios.
N-terminal
PDB: 1K6Y
Resolution: 2.40 Å
Unit Cell:
Length [Å]
a = 102.71
b = 102.71
c = 280.56
Angles [°]
α = 90.00
β = 90.00
γ = 90.00
Coro catalítico
12
Integrasa
Mapeo de mutaciones mayores y menores descritas en última
publicación (International AIDS Society 2010).
PDB: 1K6Y
Resolution: 2.40 Å
Unit Cell:
Length [Å]
a = 102.71
b = 102.71
c = 280.56
Angles [°]
α = 90.00
β = 90.00
γ = 90.00
Mutaciones asociadas a resistencia a ARV
13
Frecuencia de ARVM’s
• ARVM entre pacientes naïve entre 3-20% para Norteamérica 5 y 15% para
Europa (Girardi, 2003).
• En Argentina se ha reportado una prevalencia del 2.4%, mientras que en
Brasil es de un 6.3% (Brindeiro et al., 2003; Kijak et al., 2001).
• Pacientes HIV+ tratamiento naïve residentes de la ciudad de Guadalajara,
México, con una prevalencia del 16% (Escoto-Delgadillo et al., 2005).
• Estudios realizados en la ciudad de Monterrey, México han reportado una
prevalencia de 2.8% para la región codificante para la RT (Valle-Bahena et
al., 2006).
• Estudios realizados en pacientes de la ciudad de Tijuana, México, reportan
una prevalencia del 2.5% (Viani et al., 2007).
14
Propuesta
• Desarrollar herramientas moleculares para la identificación de
mutaciones asociadas a resistencia a anti-retrovirales y para la
caracterización de su relevancia clínica.
15
Objetivos Generales
1.
Desarrollo de las técnicas moleculares que permitan identificar las
mutaciones asociadas a resistencia a fármacos ARV en pacientes
infectados por HIV.
2.
Desarrollo e implementación de herramientas de bioinformática para
evaluar la relevancia clínica de las mutaciones asociadas a ARV.
16
Objetivos Específicos
1.
2.
Desarrollo de las técnicas moleculares que permitan identificar las
mutaciones asociadas a resistencia a fármacos ARV en pacientes
infectados por HIV.
1.
Técnica molecular para caracterización genómica en DNA proviral.
2.
Técnica molecular para caracterización genómica en RNA viral.
3.
Técnica de clonación/secuenciación de fragmentos subgenómicos región pol.
Desarrollo de herramientas de bioinformática para evaluar la relevancia
clínica de las mutaciones asociadas a ARV.
1.
Generación, edición y ensamble de contigs de región pol completa.
2.
Mapeo molecular de ARVM ya descritas hacia estructuras cristalográficas.
3.
Modelaje de ARVM aun no asociadas a resistencias e inferencia de relevancia.
17
MATERIALES Y MÉTODOS
18
Población de Estudio y Muestras
• Sueros obtenidos como parte de nuestra colaboración en el Grupo de
Trabajo en HIV de San Luis Potosí (HIV-WG) CAPASITS, LESP, HCIMP.
• Mexican Genomic DNA Collection- HIV Cohort (MGDC-HIV), 270 plasmas y
419 DNA’s individuales.
• Se eligieron 5 muestras con CV ≥ 70,900 cp/ml (determinada por LESP).
• La extracción del RNA se realizó con el kit High Pure Viral RNA de acuerdo
a las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics, Mannheim,
Alemania).
19
Estrategia de Amplificación
2085
Prot-FO
Prot-FI
2253
p15
RNase
p51 RT
PR
2550
1st PCR: 652 bp
2nd PCR: 514 bp
RT-FO2
RT-FI2
3870
p31 IN
4230
5096
Prot-RO
Prot-RI
1st PCR: 1416 bp
2nd PCR: 1058 bp
RT-FO3
RT-FI3
RT-RO3
RT-RI3
1st PCR: 1102 bp
2nd PCR: 986 bp
RT-RO2
RT-RI2
Int-FO
Int-FI
1st PCR: 1046 bp
2nd PCR: 994 bp
• Acercamiento anidado para la amplificación de cuatro fragmentos
subgenómicos que cubran el 100% de la región pol.
• Longitud total de contig de 2986 bp.
Int-RO
Int-RI
Síntesis de cDNA y PCR
•
•
RT constó de dos pasos separados de éxito
probado para amplificación de AN virales.
•
Se optimizó la temperatura de
desnaturalización de RNA (65º y 95º).
•
Se optmizó la temperatura de síntesis de
primer cadena (38º y 42º).
•
Primer PCR empleo 4 µl de cDNA.
•
Síntesis de cDNA
Tiempo
Temp. (°C)
(min)
RT-1
95
2
4
2
RT-2
42
60
95
10
4
5
Se empleo RT- PCR en dos pasos.
Se optimizó Tm para 1ra y 2da PCR de cada
fragmento.
Condiciones termociclado
T °C
Tiempo
Inicial
94
2 min
Desnaturalización
94
30 seg
Hibridización
53*
45 seg*
Elongación
72
1 min
Elongación final
72
2 min
Fase
Programa
Prot-1
Prot-2
RTa-1
RTa-2
RTb-1
RTb-2
Int-1
Int-2
TM (ºC)
50
60
55
51
54
54
60
50
Ciclos
1
1
1
1
1
Ciclos
1
30*
1
Tiempo (seg) Num. Ciclos
30
25
30
30
45
35
45
30
45
35
45
30
30
30
30
30
21
Estrategia de Clonación
Se amplifica fragmento subgenómico de interés empleando Taq
DNA Pol sin capacidad correctiva (para generar A’s terminales).
5'3'-A-
-A-3'
-5'
El empleo de DNA Pol Pfu o Ttl eliminaría adenilación terminal y
evitaría ligación.
Por ello se amplificaron fragmentos pequeños versus región pol
completa con Long Range PCR.
Permite almacenar clonas con fragmentos subgenómicos para
servir de referencia.
pGEM-T Easy Vector
(Promega Corporation, Wisconsin EUA)
Permite eliminar ambiguedades resultantes de la co-amplificación
de cuasiespecies virales.
22
Protocolo Genérico de Clonación
Rx
H2O
pGEM-T vector
Prod. PCR
T4 DNA ligasa
Vf
Volumen
3.5 μl
0.5 μl
0.5 μl
0.5 μl
10 μl
Incubar ½ hrs
a RT seguido
de 12 hrs a
4ºC
Producto de ligación
(3 μl)
Producto de PCR
Células competentes
JM109 (10 μl)
Baño de hielo
(30 min)
Choque térmico a 42°C
(30 seg)
Baño de hielo
(2 min)
100 μl de inóculo
Incubación 37°C, 1 h en
medio LB (250 μl)
LB
bencilpenicilina (100 g/ml)
IPTG (0.5 mM)
X-Gal (80 g/ml)
Selección fenotípica de
colonias con el inserto
(blancas).
23
Extracción del DNA y Secuenciación
• Kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega Corporation, Wisconsin
EUA) utilizando el protocolo para el aislamiento de DNA genómico de
bacterias Gram-negativas.
• Se realizó PCR sobre el DNA extraido para verificar presencia del
fragmento subgenómico insertado.
• El producto restante se envió a secuenciar al Laboratorio Nacional de
Genómica para la Biodiversidad del CINVESTAV Irapuato (Guanajuato,
México) sin purificar.
• Se solicitó secuenciación en dos direcciones y el envio de
electroferogramas sin manipular o editar.
24
Procesamiento y Edición de Secuencias
• Localmente nosotros editamos los electroferogramas con el programa
4Peaks versión 1.7.2 (A. Griekspoor & Tom Groothuis) para elminar
ambigüedades y restringir a regiones de alta calidad.
• Las secuencias fueron exportadas como archivos de texto simple y las
correspondientes al mismo fragmento subgenómico combinadas
empleando la herramienta ClustalW2 (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2).
• El ensamblaje del contig (combinando los cuatro fragmentos
subgenómicos) para cada muestra se realizó con la aplicación HIValign de
Los Alamos National Laboratory HIV Database
(www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HMM/HmmAlign.html).
Procesamiento y Edición de Secuencias
• Se utilizó la herramienta Alignment Reformatting de James Robinson para
ilustrar unanimidad. Esta se encuentra hospedada en nuestro servidor
local (www.genomica.uaslp.mx/Herramientas/reformat.html).
• Esta misma herramienta nos permitió realizar la traducción de la
secuencia nucleotídica a la aminoacídica.
• Los contigs armados fueron alimentados a la herramienta Quality Control,
de Los Alamos National Laboratory HIV Database
(www.hiv.lanl.gov/content/sequence/QC/index.html).
• Los contigs de la región pol completa de las cinco muestras fueron
enviados a la base de datos GenBank de NCBI.
Análisis de Homología
• Se basó en comparaciones filogenéticas y métodos de bootscanning de
ventana deslizante empleando la herramienta REGA HIV-1 subtyping tool
versión 2.0 (dbpartners.stanford.edu/RegaSubtyping/).
• Para los histogramas de soporte estadístico se empleó una ventana de 400
bp con pasos de 50 bp.
• El umbral para la detección de eventos recombinatoriales se fijó en 70%
de soporte estadístico (bootscan confidence).
27
Genotipificación de ARVM
•
Se utilizó la herramienta HIVdb: Genotypic Resistance Interpretation
Algorithm, de la Universidad de Stanford
(sierra2.stanford.edu/sierra/servlet/JSierra).
• Esta herramienta nos permitió identificar la presencia de corrimientos del
marco de lectura, inserciones/deleciones y la presencia de codones
inusuales.
• También permitió evaluar la presencia de mutaciones asociadas a
resistencia a inhibidores de PR, RT (NRTI y NNRTI) e IN.
28
Mapeo de ARVM´s
•
Se utilizaron modelos
cristalográficos obtenidos de Protein
Data Bank para PR (3OXC), RT
(2WON) e IN (1K6Y).
•
Difracción de rayos X de fuente de
radiación sincrotrónica a 1.16, 2.8 y
2.4 Å.
•
Las estructuras cristalográficas
fueron manipuladas y procesadas
empleando MacPyMOL.
•
Modelos moleculares fueron
generados empleando ExPASy.
29
RESULTADOS
30
RNA vs DNA Clonado
• Amplicones limpios de tamaño esperado, sin productos de amplificación
inespecífica de menor o mayor peso.
• Rendimiento de amplicones depende de cantidad de template inicial (RNA vs
DNA).
• Buen rendimiento de productos largos de RNA (RTa 1058).
• Amplicón Prot (el menor) obtenido incluso de muestras de menor CV.
PM
1
Prot
2
RTa
3
RTb
RNA
4
Int
5
Prot
6
RTa
7
RTb
8
Int
DNA
MX-HIV-0395
31
Secuenciación
• Se obtuvieron electroferogramas de excelente calidad en ambas direcciones.
32
Ensamblaje de los Contigs
• La longitud promedio después de armar el contig para cada fragmento fue
de 475 para Prot, 954 para RTa, 878 para RTb y 895 bp para Int.
• La longitud promedio de los contigs de la región pol completa fue de 2950
bp.
• Los contigs de la región pol completa fueron enviados para su inclusión a
GenBank, bajo los siguientes números de accesión: JN157829, JN157835,
JN157836, JN157837 y JN157838.
33
Ensamblaje de los Contigs
• Primera vez que se caracteriza la
genómica de regiones pol completas
de aislados mexicanos.
• Secuencias clonadas disponibles
para distribución a otros
investigadores/laboratorios.
• Células competentes clonadas
capaces de ser empleadas para
generar vectores de expresión de las
enzimas.
34
Cobertura
• Se amplificó la región codificante completa de la región pol, parte de la
región de deslizamiento ribosomal y parte de la región Vif.
Inserciones/deleciones
• Inserción de tripletes identificada en la región de deslizamiento ribosomal
que permite transicionar de gag a pol.
• No presentes en ningún otra región.
2,198
2,240
2,241
2,199
2,220
Localización de las ARVM de PR
Flap
• 19 residuos
polimórficos en PR,
19.2% de los residuos
totales de la proteína
Coro
Terminal
•
El 52.6% (n=10) de dichas substituciones no-sinónimas se
concentraron en el dominio de coro, 10.5% (n=2) en el dominio
terminal y 36.8% (n=7) en el dominio del flap.
37
Localización de las ARVM de RT
Lervisirina
Dedos
• En RT se encontraron 72
residuos polimórficos.
Pulgar
Palma
Conector
• Esto corresponde a
12.8% de los codones
totales que conforman a
la proteína.
RNasa H
p51
• 29.2% se concentraron en el dominio de RNasa H (n=21), 26.4% en el
conector (n=19), 16.7% en el la palma (n=12), 15.3% en el pulgar (n=11)
y 12.5% en el de dedos de la RT (n=9)
38
Localización de las ARVM de IN
• Para IN se identificó la
presencia de 36 residuos
polimórficos (substituciones
no-sinónimas).
N-terminal
• Corresponden al 12.4% de
los codones totales de la
proteína.
Coro catalítico
• El 50% de los residuos polimórficos se ubicaron en el coro catalítico de la IN,
27.8% y 22.2% se localizaron en los dominios Amino- y Carboxy-terminales,
respectivamente.
39
Codones de Paro
• Para PR se localizó un codón de paro en la muestra MX-HIV-0422 en la
región del flap de PR (residuo 43).
• En RT se localizó un codón de paro prematuro en la posición 383 de la
muestra MX-HIV-0401.
40
Codones de Paro
• En IN se detectó la presencia de dos codones de paro prematuros en la
región del dominio C-terminal en las posiciones 252 y 221 de las muestras
MX-HIV-0327 y MX-HIV-0422, respectivamente.
41
Análisis de Homología
• Nuestras secuencias demostraron ser más similares a las de subtipos B en
el análisis de fragmento completo (BLAST).
• El análisis de homología proteica realizado para cada enzima por separado
demostró una similaridad de:
– 93.82% para las PR (desde 92.3% hasta 94.6%)
– 94.38% para las RT (desde 93.3% hasta 95.2%)
– 95.44% para las IN (desde 94.7% hasta 95.9%)
• No obstante, también se demostró la presencia de zonas dentro de la
región pol con menor homología para con subtipos B y más parecidas a
otros subtipos.
42
Eventos de Recombinación
• Ventajas de estrategia de
ventana desplazante.
• Evidencia de eventos
recombinatoriales
ancestrales.
• Información sobre evolución
de cepas nacionales.
• Información de soporte
estadístico.
• Mapeo de regiones de
acuerdo a homología.
43
Mutaciones de Resistencia
• En los cinco aislados clínicos se detectaron 118 mutaciones, 19 en las
secuencias de la PR y 99 en las de la RT.
• En PR se detectaron cuatro mutaciones menores asociadas a resistencia a
ARV (L10I, G48R, A71T, I84T) y 15 mutaciones no asociadas a resistencia.
• En RT se encontraron 4 mutaciones asociadas a resistencia (M41L, K103N,
T215D, T215A) y 95 no asociadas.
• Ningún aislado clínico presentó ARVM de relevancia clínica con relación a
inhibidores de IN.
44
Mapeo Cristalográfico de ARVM’s
• G48R es una mutación inusual para esta posición.
• A71T es un polimorfismo común a 2-3% de las personas no tratadas pero
cuya frecuencia se incrementa en pacientes que reciben inhibidores de la
proteasa.
• I84T es una mutación muy inusual en esta posición.
45
Mapeo Cristalográfico de ARVM’s
•
•
M41L concurre con T215Y y juntas confieren resistencia de nivel intermedio a
nivel alto al zidovidina y stavudina al igual que resistencia de bajo nivel a
didanosina, abacavir y tenofovir.
T215D son transiciones entre mutaciones Y y F y wild-type. La mayoría no
reducen la susceptibilidad a NRTI’s pero su presencia pudiera sugerir la
presencia concurrente de T215Y o F.
46
Mapeo Cristalográfico de ARVM’s
• K103N ocasiona resistencia de alto nivel a nevirapina, delavirina y a
efavirenz.
47
Modelaje Cristalográfico de ARVM’s
• Además de mapear la presencia de ARVM’s ya asociadas a resistencia, el
mapeo, mutagénesis in silico y modelaje molecular permiten analizar el
impacto de otras mutaciones
–
–
–
–
Cambios de estructura de residuos
Cambios de propiedades físicoquímicas (polaridad, electronegatividad, fobicidad, etc).
Proximidad a sitios catalíticos, antigénicos o de relevancia funcional para la dimerización.
Proximidad a lugar de acomplamiento de inhibidores.
48
Reporte de las Mutaciones
•
Primeros reportes de ARVM ya
entregados al HIV-WG de San Luis
Potosí.
•
Información ha sido acomplada a
expedientes de pacientes.
•
Grandes expectativas de parte de
participantes, en particular de parte
del CAPASITS San Luis Potosí.
•
Pendiente la referencia de muestras
de dos pacientes de Cd. Valles en
falla terapéutica con muy mal
comportamiento virológico.
49
Reporte de las Mutaciones
•
Primeros reportes de ARVM ya
entregados al HIV-WG de San Luis
Potosí.
•
Información ha sido acomplada a
expedientes de pacientes.
•
Grandes expectativas de parte de
participantes, en particular de parte
del CAPASITS San Luis Potosí.
•
Pendiente la referencia de muestras
de dos pacientes de Cd. Valles en
falla terapéutica con muy mal
comportamiento virológico.
50
Reporte de las Mutaciones
•
Primeros reportes de ARVM ya
entregados al HIV-WG de San Luis
Potosí.
•
Información ha sido acomplada a
expedientes de pacientes.
•
Grandes expectativas de parte de
participantes, en particular de parte
del CAPASITS San Luis Potosí.
•
Pendiente la referencia de muestras
de dos pacientes de Cd. Valles en
falla terapéutica con muy mal
comportamiento virológico.
51
DISCUSIÓN
52
RNA Viral
• Se optó por utilizar RNA ya que éste representa mejor a las cuasiespecies
de mayor replicación en en el hospedero humano.
• Se ha comprobado que en el RNA viral se refleja más rapidamente el
surgimiento de ARVM en comparación al DNA proviral integrado (Bi et al.,
2003; Devereux et al., 2000; Quan et al., 2008).
• Optimizamos técnica para muestras con CV ≈70,000 cp/ml a pesar de que
los individuos se consideran en falla terapéutica en presencia de CV ≥
1,000 cp/ml (Dagnra et al.; Orrell et al.).
• No obstante, en la práctica la mayor parte de los pacientes con HIV sujetos
a tratamiento ARV de la cohorte de estudio bajo seguimiento por HIV-WG
suelen presentar CV ≥ 100,000 cp/ml.
53
Inserciones/deleciones
• La presencia sólo de inserciones y deleciones en la región de
deslizamiento ribosomal, nos indica que es una región sujeta a una menor
presión selectiva.
• En regiones como PR, RT o IN cambios de este tipo podrían afectar la
actividad catalítica de las enzimas y por consiguiente el fitness viral (Bleiber
et al., 2004; Ishima et al., 2001; Villena et al., 2007).
54
Localización de las ARVM’s
• Menos de la mitad de las
mutaciones encontradas
fueron no-sinónimas (44.2%
para PR, 32.6% para RT y
34.6 para IN).
• Para PR e IN se identificaron
más mutaciones nosinónimas en los sitios
activos de las enzimas (en
el dominio de coro en PR y
en IN en el coro catalítico).
Flap
Coro
Terminal
• En el caso de PR, esto se explica por una mayor presión selectiva inducida
por el tratamiento ARV (Boden and Markowitz, 1998).
55
Posición de las Mutaciones
Lervisirina
Dedos
• En los dominios de dedos,
pulgar y palma de la RT se
encontro menor cantidad
de mutaciones nosinónimas versus RNasa H.
Pulgar
Palma
Conector
RNAsa H
• El dominio RNasa H fue el
que más mutaciones nosinónimas presentó.
p51
• Algunos estudios indican que el dominio RNasa H está involucrado en la
resistencia a los NRTI (Nikolenko et al., 2005; Santos et al., 2008).
56
Conclusiones
• Se desarrollo la capacidad de inferir la relevancia clínica de mutaciones
aun no caracterizadas.
• Se generó una colección de plásmidos, bacterias transformadas y
partículas virales bien caracterizadas (tanto genómica como clínicamente).
• Sienta las bases para la realización de proyectos de caracterización
genómica y epidemiología molecular de mayor escala.
• Complementa el arsenal de ensayos moleculares disponibles en el LGVH y
permite el manejo integral de pacientes del sector público.
57
Conclusiones
• Estas herramientas tienen como finalidad ser un respaldo en la elección
del tratamiento ARV más adecuado para el paciente, al identificar las
mutaciones que presente que puedan conferir resistencia al tratamiento y
por consiguiente disminuir su eficacia.
• Este proyecto se convirtió en el primero del LGVH en transferir los
beneficios de la era posgenómica a pacientes del sector público.
• Se adoptó y cumplió con la responsabilidad de responder a una demanda
sanitaria impuesta por restricciones económicas del sector público.
• Se desarrollaron herramientas robustas, económicas y de punta
tecnológica para detectar ARVM de conocida relevancia clínica.
58
Agradecimientos
• A mi familia.
• A mis amigos (compañeros de maestría y del laboratorio).
• Y a CONACYT por la Beca otorgada.
59
60
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