Anticuerpos irregulares clínicamente
significativos y su detección pre
transfusional
Dra Fabiana Bastos
División Inmunohematología
Departamento de Hemoterapia e Inmunohematología
Hospital de Clínicas “José de San Martín”
Universidad de Buenos Aires
[email protected]
ANTICUERPOSc
• REGULARES o ESPERADOS
=
• IRREGULARES o INESPERADOS
ANTICUERPOS
• IRREGULARES o INESPERADOS
– Aloanticuerpos INMUNES: en respuesta al
estímulo con glóbulos rojos
• Transfusión
• Embarazo
• Trasplante
ANTICUERPOS
• IRREGULARES o INESPERADOS
– Aloanticuerpos ocurrencia NATURAL: en
respuesta a estímulos ambientales
• Polen
• Hongos
• Bacterias
ORIGEN DE ANTICUERPOS INMUNES
P orc e nt a je ind ivid u os
A nt e c e d e nt e s
se nsib iliz a d os
F em enino solo
1 %
em b a ra z a d a
F em enino em b a ra z a d a y
2 .8 %
t ra nsfu nd id a
M a sc u lino y F em enino
1 .4 %
solo t ra nsfu nd id o
M a sc u lino y F em enino
sin a nt ec ed ent es
0 .4 %
Detección de anticuerpos irregulares
• Juega un papel fundamental en la medicina
Transfusional
• Es un proceso clave en las pruebas de
compatibilidad pre-transfusión
• El objetivo de los métodos de detección es el
hallazgo de los anticuerpos irregulares o
inesperados
• Presentes en 0.2 - 2 % de la población general
ANTICUEPOS CLINICAMENTE SIGNIFICAIVOS
• Capaces de iniciar la destrucción acelerada de los
glóbulos rojos portadores del antígeno
• ISBT >300 antígenos 30 sistemas de grupo
sanguíneo
• Especificidades asociadas con:
– EHFN
– RHPT
– Acortamiento de la sobrevida de los GR transfundidos
– AHAI
Destrucción de GR
alogénicos transfundidos
Reacción hemolítica
postransfusional
Destrucción de GR
autólogos
Anemia Hemolítica
Autoinmune
Destrucción de GR
fetales
Daño tejidos
trasplantados
Enfermedad Hemolítica
Feto Neonatal
Rechazo del injerto
RHP Intravascular
• Síntomas
– Fiebre
– Escalofríos
– Shock
– Hipotensión
– Hemoglobinemia
– Hemoglobinuria
– IRA
– CID
RHP Intravascular
– Hemólisis rápida 10 min
– IgM, fija C
– 10% desenlace fatal
• Anticuerpos implicados:
– ABO
– PP1PK
– Vel
– Lewis
– Kidd
RHP Extravascular
• IgG (IgG1 o IgG3)
• Inmediata: durante o dentro de pocas horas:
– Ac serológicamente detectable
• Hiperbilirrubinemia
• Anticuerpo implicados:
– Kidd
– Rh
– Duffy
RHP Extravascular Tardía
•
•
•
•
•
•
Pacientes previamente inmunizados
Ac presente
Serológicamente indetectable
Transfusión inicia respuesta anamnésica
5-7 días postransfusión (2-23 días)
Fiebre,  Hto/Hb, ictericia, hemoglobinuria
Factores que determinan la
importancia clínica
•
•
•
•
•
•
Especificidad del anticuerpo.
La concentración y la avidez de los anticuerpos.
Rango térmico
Clase y subclase de inmunoglobulina
Actividad del sistema mononuclear fagocítico.
Movilidad y densidad de sitios antigénicos en la
membrana.
• Volumen de glóbulos rojos administrados.
• Presencia de sustancias solubles del grupo
sanguíneo
Factores que determinan la
importancia clínica
• Algunas especificidades tienen un
comportamiento variable
• No siempre podemos distinguir entre un Ac
clínicamente significativo y uno benigno
• No contamos con información inequívoca del
comportamiento de algunos especificidades
poco comunes
• A veces no podemos precisar la especificidad
de un Ac determinado
Importancia clínica
Clínicamente
significativos
Significativos si
reaccionan a 37ºC
Significativos
algunas veces
Clínicamente
benignos
ABO
Lea
Yta
Chido/Rodgers
Rh
M, N
G
JMH
Kell
P1
Gya
Knops
Duffy
Lutheran
Hy
Bg
Kidd
A1
Ata
Xg
SsU
Sda
Colton
Csa
Vel
AnWj
Cromer
Yka
PP1Pk
Dombrock
McCa
H (Oh)
Indian
Jra
Lan
LW
Scianna
Suelen producir RHPT
Anticuerpos
Comentarios
ABO, H
RTHI intravascular graves
Rh(D,C,c,E,e)
RTH inmediatas y retardadas
K,k,Ku / resto
RTH inmediatas / retardadas
Fya, Fyb, Fy3
RTH inmediatas y retardadas
Jka, Jkb, Jk3
RTH inmediatas y retardadas
1/3 de RTH retardadas son por anti-Jka
S,s,U,Mur*,Mia*,Vw,Far,Ena
RTH inmediatas y retardadas
*Frecuentes en Sudeste Asiático
Doa, Dob
RTH inmediatas y retardadas
P, PP1Pk (Tja)
RTH inmediatas graves
Vel
RTH inmediatas graves
AnWja (CD44)
RTH inmediatas graves
Wra
RTH inmediatas graves
Coa / Cob, Co3
RTH retardadas / RTH leves
Kx, Km
RTH inmediatas graves
Raramente producen RHPT
Anticuerpos
Excepciones
A1, Lewis, P1, LKE, I
Suelen ser IgM no activos >25ºC
P1, A1, Lea, Leb : RTH Inmediatas y
Retardadas
Lua, Lub
Algunas RTHR moderadas
Sistema Diego
Wra es la excepción
Yta, Scianna, LW, Ch/Rg, Ge, Cr, Kn, In,
Er, COST, Xga, MER2, JMH, GIL, LKE,
Sda, Lan, Ata, Jra, Emm
Yta, Tca(Cro2), Inb, Lan, Ata, Jra: RTH
grave
1 caso de RTHI por anti-JMH
Oka, GIL, PEL, MAM
No hay referencias, pero son
potencialmente hemolíticos
Habitualmente producen EHFN
Anticuerpos
Comentarios
Rh(D), c
C, E, e, G
Ce(f), Ce, Cw, Ew, Hro, Hr, Rh29,, Goa, Rh32,
Bea, Evans, Tar, Sec, JAL, MAR-like
EHRN grave y frecuente
EHRN ocasional
K
K, Kpa, Jsa, Jsb, Ula, Ku, K22
Anemia aplásica > Anemia hemolítica
EHRN leve
ABO
EHRN poco frecuente
S,s,U
M
Ena, Mia, Vw, Mur, Hut, Hil, Mta, Mv, Far, sD, Or,
Mut, Mur
EHRN grave
EHRN excepcionalmente grave
EHRN ocasionalmente grave
Fya,Fyb
EHRN leve, grave. 1 caso por anti-Fyb
Jka, Jkb
No suelen producir EHRN. 1 caso grave
Coa, Cob
EHRN grave
Dia, Dib, Wra, ELO, Bow
Pocos casos. EHRN grave
Ge
Gralmente no causan EHRN
2 casos graves. Inhibe la eritopoyesis
HJK, Kg, REIT, JVF, JONES, MAM
Pocos casos. EHRN grave
Raramente producen EHFN
Anticuerpos
Comentarios
Anti-PP1Pk (fenotipo p)
Se asocian a abortos recurrentes 1er
trimestre.
Lua, Lub
Ags poco desarrollados en el feto.
Acs adsorbidos por la placenta.
Lea, Leb
No activos a 37ºC.
No se expresan en el feto.
Acs de los sistemas: Yt, Do, LW, Ch/Rg, Cr,
Kn, In
Acs: Cost, Er, Sc1, Sc2, Sc3, Xga, Oka,
MER2, JMH, GIL, Emm, AnWj, Sda, Duclos,
PEL, ABTI, HLA
No se han descrito casos de EHRN grave.
Vel
Sólo formas leves.
1 caso por anti-Duclos.
IgM. Poco expresado en el feto.
Lan, Ata, Jra
Sólo formas leves.
1 caso reciente grave por anti-Jra.
Anticuerpos poco comunes
•
•
•
•
Conocer la etnia del paciente
Conocer la historia clínica del paciente
Conocer hallazgos serológicos previos
Conocer medios óptimos de reacción,
temperatura, etc
Especificidades relacionadas con la
etnia
• En un paciente de raza blanca, los Ac contra Ag
de alta frecuencia se dirigen con mayor
frecuencia contra: k, Kpb, Yta, Vel, Coa y Lub.
• En individuos de raza negra los fenotipos S-s-UJs(b-) y hrs son exclusivos, y los fenotipos Fy(ab-), Le(a-b-), Cr(a-) y Lu(b-) son más comunes
Especificidades relacionadas con la
etnia
• El fenotipo In(b-) es exclusivo de la raza
asiática, y los fenotipos Gy(a-), Jr(a-) y Di(a+b-)
son mucho más frecuentes
• En latinoamericanos: Di(a+b-), Ge:-2,3 y
Ge:-2,-3.
• En el este de Europa es más común el fenotipo
Gy(a-).
REACTIVOS GLOBULARES
• Cada frasco contiene suspensión globular
(0.8-6%) de un individuo
• Deben estar tipificados al menos para los
antígenos
• D, C, E, c, e, P1, Lea, Leb, K, k, Fya, Fyb, Jka,
Jkb, M, N, S, s
• Cada lote se manufactura con donantes
diferentes
• Cada lote se mantiene por 45 días
TECNICA
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Colocar una gota de suspensión globular en un tubo
Colocar dos gotas de suero en estudio
Centrifugar y leer
Incubar a 37ºC 30 minutos
Centrifugar y leer
Lavar tres veces con solución fisiológica
Agregar dos gotas de suero de Coombs
Centrifugar y leer
En los negativos agregar Control Coombs
INTERPRETACION
¿En que fase ocurrió la reacción?
¿cuál es el resultado del control autólogo?
¿Cuántas células reaccionan?
¿Reaccionan con la misma fuerza y en la
misma fase?
• ¿Hay hemólisis o campo mixto?
• ¿Están realmente aglutinados los GR o se
debe a fenómeno de rouleaux?
•
•
•
•
INTERPRETACION
• ¿En que fase ocurrió la reacción?
– IgG reacciona mejor en fase antiglobulínica. Pueden ser
aglutinantes a 37ºC.
– IgM reacciona mejor a baja temperatura y es capaz de
aglutinar GR suspendidos en solución fisiológica a
temperatura ambiente.
– Hay IgM que pueden reaccionar en SAGH debido a la
fijación de complemento.
INTERPRETACION
C L A S E D E Ig IN V O L U C R A D A
TA
37º C
SAG
+
o
o
1 ) Ig M
o
o
+
2 ) Ig G
+
+
o
3 ) Ig M
+
o
+
4 ) Ig M q u e fija C ’
o
+
+
6 ) Ig G “ a g lu tin a n te ”
+
+
+
3, 4, 5, o
(a lto r a n g o té r m ic o ), (r a r a ).
6
o 5 ) Ig M + Ig G
INTERPRETACION
• ¿Cuál es el resultado del control autólogo?
– Se realiza enfrentando el suero del paciente con sus
propios GR de la misma forma que se enfrenta a células
del panel celular.
– Control autólogo negativo en presencia de una detección
de anticuerpos irregulares positiva indica la presencia de
un Aloanticuerpo.
– Control autólogo positivo indica la presencia de
autoanticuerpos, anticuerpos inducidos por drogas.
INTERPRETACION
• ¿Cuál es el resultado del control autólogo?
– Si el paciente ha sido recientemente transfundido el
control autólogo positivo puede deberse a la presencia de
una aloanticuerpo unido a los GR transfundidos.
– La evaluación de muestras con control autólogo positivo o
PCD positiva resulta en un problema complejo de resolver
que necesita de la experiencia del operador.
– El control autólogo puede omitirse durante la DAI pero
debe realizarse en la identificación.
INTERPRETACION
• ¿Cuántas células reaccionan? ¿Reaccionan con la
misma fuerza y en la misma fase?
– Presencia de un único anticuerpo dirigido contra un
antígeno presente en ambas células del panel:
• Todas las células reaccionan en la misma fase y con la misma
intensidad
– Presencia de múltiples anticuerpos.
• Las células reaccionan con diferente intensidad o en diferentes
medios
– Presencia de autoanticuerpos.
• Autocontrol positivo
INTERPRETACION
• ¿Hay hemólisis o campo mixto?
– Anti-Lea, anti-Leb, anti-Vel y anti-PP1Pk producen hemólisis
in vitro
– Anti-Sda, Lua y Lub producen reacciones en campo mixto.
INTERPRETACION
• ¿Están realmente aglutinados los GR o se debe a
fenómeno de rouleaux?
– Se observa en todas las pruebas que contengan suero del
paciente (autocontrol, inversa ABO)
– Pacientes con relación albúmina-globulinas alterada (por
ej. mieloma múltiple)
– Pacientes que recibieron expansores plasmáticos (por ej.
Dextran)
– No interfiere con la fase aniglobulínica de las pruebas de
detección e identificación de anticuerpos irregulares
EFECTO DOSIS
Fya Fyb
HETEROCIGOTA
El panel “ideal” tiene G.R. con
expresión homocigota para
la mayor cantidad de Ags posibles.
(que expresen efecto de dosis).
Fya Fya
HOMOCIGOTA
Fya Fyb SAG
+
+
2+
+
o
4+
o
o
o
Si el resultado fuera anti-Fya
¿Qué antígenos del panel celular
NO expresan
EFECTO DE DOSIS con sus
respectivos anticuerpos?
I, i, Lea, Leb, P1
LIMITACIONES
• Relación suero-células
– Exceso de anticuerpos
– Exceso de antígenos
– Puede aumentarse la relación a 4 gotas de suero
para detectar anticuerpos débiles sin agregar
potenciadores.
• Temperatura
• Tiempo de incubación
• pH
LIMITACIONES
• Tiempo de incubación
– Reacciones Ag-Ac están en equilibrio dinámico
– El rango de tiempo es entre 30-60 minutos para
sistemas preparados en solución salina
– Los medios potenciadores pueden disminuir este
tiempo a 10 minutos
LIMITACIONES
• pH
– Mayoría de los anticuerpos reaccionan entre 6.8 y
7.2
– Hay ejemplos de anti-M que reaccionan mejor a
6.5
METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE
IDENTIFICACION
• Control antólogo
• Exclusión
• Inclusión
• Tipificación GR del paciente
• Calculo de error
METODO PARA INTERPRETAR
RESULTADOS DE IDENTIFICACION
• Exclusión
– Excluir aquellas especificidades que no son
responsables de la reactividad observada
– Examinar las células con resultados negativos en
todas las fases
– Los antígenos presentes en las células que no
reaccionaron no son el blanco del anticuerpo
presente en el suero
– EFECTO DE DOSIS
METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE
IDENTIFICACION
• Evaluar los resultados
– Inclusión: evaluar los resultados obtenidos y
comparar con la clave para cada especificidad
• Tipificar GR del paciente
– Debe estar ausente el antígeno hacia el cual está
dirigido el/los anticuerpos.
• Calculo de error
METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE
IDENTIFICACION
• Calculo de error
Tablas de 2 x 2 para calcular niveles de
probabilidad (Fisher)
REACCION DEL
SUERO
POSITIVO
NEGATIVO
TOTAL
GLÓBULOS ROJOS
ANTIGENO
PRESENTE
ANTIGENO
AUSENTE
3
0
0
3
TOTAL
6
METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE
IDENTIFICACION
• Pensar en mas de una especificidad
– La “clave”observada NO se ajusta a la de un sólo
anticuerpo
– Se observan reacciones de intensidad variable, que NO se
explican por “efecto de dosis”.
– Diferentes hematíes reaccionan en distintas fases
– Al intentar confirmar la especificidad de un único Ac, se
obtienen resultados inesperados.
lote
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
AC
D
C
E
c
e
Cw
K
k
Fya
Fyb
Jka
Jkb
P1
Lea
Leb
M
N
S
s
TA
37
SAG
ENZ
+
+
o
o
+
+
o
+
+
o
+
o
o
o
+
+
+
o
+
O
O
O
O
+
+
o
o
+
o
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+
o
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o
+
+
o
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+
+
+
O
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O
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+
o
+
+
o
o
o
+
+
o
o
+
+
o
+
+
o
o
o
O
O
3+
4+
o
+
o
+
+
o
o
+
+
+
o
+
+
o
o
+
+
+
+
O
O
O
O
o
o
+
+
+
o
o
+
o
+
+
+
+
+
o
+
+
+
+
O
O
1+
4+
o
o
o
+
+
o
+
+
o
+
o
+
+
o
o
o
+
+
+
O
O
O
O
o
o
o
+
+
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+
o
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o
+
+
+
O
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O
O
+
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+
o
o
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+
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+
O
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O
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o
o
+
+
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+
o
+
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+
+
+
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O
O
O
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+
+
o
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o
+
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o
+
o
+
+
O
O
O
O
o
o
o
+
+
o
o
+
+
o
+
o
o
o
o
+
o
+
+
O
O
O
O
METODO para interpretar los resultados
• CONTROL AUTOLOGO ?
– NEGATIVO
ALO ANTICUERPO
• EXCLUSION
– Qué Ag siguen implicados luego de la exclusión
• TIPIFICACION GR PACIENTE
– Ag ausente en membrana del GR
• INCLUSION
– La clave obtenida coincide con alguna prevista en el panel?
• CONFIRMAR PROBABILIDAD DE ERROR
lote
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
AC
D
C
E
c
e
Cw
K
k
Fya
Fyb
Jka
Jkb
P1
Lea
Leb
M
N
S
s
TA
37
SAG
ENZ
+
+
o
o
+
+
o
+
+
o
+
o
o
o
+
+
+
o
+
O
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+
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+
+
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+
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+
+
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+
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o
o
O
O
3+
4+
o
+
o
+
+
o
o
+
+
+
o
+
+
o
o
+
+
+
+
O
O
2+
4+
o
o
+
+
+
o
o
+
o
+
+
+
+
+
o
+
+
+
+
O
O
2+
4+
o
o
o
+
+
o
+
+
o
+
o
+
+
o
o
o
+
+
+
O
O
2+
4+
o
o
o
+
+
o
o
+
+
o
o
+
o
o
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o
+
+
+
O
O
2+
4+
+
o
o
+
+
o
o
+
o
o
+
o
+
o
o
+
+
+
+
O
O
2+
4+
o
o
o
+
+
o
o
+
o
+
+
o
+
+
+
+
o
o
o
O
O
2+
4+
o
o
o
+
+
o
o
+
o
+
o
+
o
o
o
+
o
+
+
O
O
2+
4+
o
o
o
+
+
o
o
+
+
o
+
o
o
o
o
+
o
+
+
O
O
2+
4+
METODO PARA INTERPRETAR
RESULTADOS DE IDENTIFICACION
• NO excluidos
–c
–E
– Lea
• NO excluidos por heterocigota
–M
–S
METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE
IDENTIFICACION
• Inclusión: la clave obtenida coincide con
alguna especificidad del panel?
–c
• Tipificación GR del paciente
– R1R1
TECNICA EN GEL
TECNICA EN GEL
TECNICA EN GEL
TECNICA EN GEL
TECNICA EN GEL
TECNICA EN GEL
TECNICA EN GEL
TECNICA EN GEL
TECNICA EN GEL
Aglutinación
Gel
Muchas Gracias
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Anticuerpos irregulares clínicamente