Table 1. Immobilization of Branchzyme® onto glutaraldehyde-agarose
a Amount
of immobilized protein as percentage of the amount of applied protein (protein immobilization yield).
of immobilized activity as percentage of the amount of applied activity (activity immobilization yield).
Soluble enzyme specific activity: 27.4 ± 3.5 EU/mg
b Amount
Generación enzimática de quitooligosacáridos a partir
de quitosano utilizando una glicosiltransferasa
(Branchzyme ®) soluble e inmovilizada
A Montilla2, A. I. Ruiz-Matute2, N. Corzo2, C. Giacomini1, G. Irazoqui1
1Catedra de Bioquimica, Dpto. de Biociencias, Facultad de Quimica, UdelaR,
Montevideo, Uruguay; 2Dpto. Bioactividad y Analisis de Alimentos. Instituto de Investigacion en
Ciencias de la Alimentacion, CIAL (CSIC-UAM), Madrid, España.
Introducción
Los quitooligosacáridos (COS) poseen propiedades biológicas destacables tales como actividad antibacterial y antitumoral al
igual que la capacidad de promover un aumento de las defensas en la salud animal. Los mismos pueden ser obtenidos
mediante la hidrólisis enzimática del quitosano. Dado el alto costo de las quitosanasas, resulta importante el estudio de
enzimas alternativas que aunque no presenten actividad quitosanasa específica sean capaces de catalizar su hidrólisis.
En este trabajo se realizó la caracterización bioquímica para la actividad quitosanasa de una glicosiltransferasa
(Branchzyme®), y se estudio su performance en forma soluble e inmovilizada, en la formación de quitooligosacaridos.
Métodos
Branchzyme
El avance de la
reacción se siguió
+
n
n
por cuantificación
del poder reductor utilizando el método de DNS.
Para la determinación de actividad quitosanasa se definió la unidad de enzima como la cantidad de enzima necesaria para formar
un mol de poder reductor (expresado como D-glucosamina) por hora a 50°C y pH 5.3.
La reacción de formación de los COS se siguió por SEC-HPLC.
La caracterización de los quitooligosacáridos se realizó por cromatografía gaseosa con detector de índice de llama (GC-FID) y por
espectrometría de masa (MALDI-ToF MS)
La inmovilización de la Branchzyme se realizó sobre geles de glutaradehído-agarosa.
Actividad unida al gel
%a
mg/g gel
4.8 ± 0.5
gel %b
EU/g
67.4 ± 11.4
Actividad
específica uida
al gel (EU/mg)
33.2 ± 4.7
17.2 ± 4.6
6.9 ± 0.5
97 KDa
64 KDa
45 KDa
30 KDa
20.1 KDa
pH óptimo
1.0
0.8
0.6
Cantidad de proteína inmovilizada expresada como porcentaje de la cantidad de proteína aplicada (rendimiento de inmovilización por proteína).
de actividad inmovilizada expresada como porcentage de la cantidad de actividad aplicada (rendimiento de actividad aplicada).
Actividad específica de la enzima soluble: 27.4 ± 3.5 EU/mg
14.4 KDa
b Cantidad
Tabla2. Parámetros cinético de Branchzyme soluble e inmovilizada
Enzima
KM (mg
quitosano/mL)
VMax
(mol
glucosamina/h.mg)
Soluble
4.0 ± 0.8
72.7 ± 7.0
Inmovilizada
8.3 ± 2.5
21.5 ± 4.6
SDS-PAGE.
1- Marcadores de PM;
2- Branchzym
Temperatura óptima
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0.0
0.0
4.0
a
1.4
Activividad Relativa
Proteína unida al gel
sobre glutaraldehído-agarosa
1.2
4.5
5.0
5.5
6.0
El PM de la enzima determinado por
cromatografía de exclusión molecular
utilizando una columna Superdex 200
10/30 fue de 256Kda. La SDS-PAGE
demuestra la presencia de monómeros de
64 Kda. Esto permite concluir que la
enzima es un homo tetrámero de PM 256
Kda
30
6.5
pH óptimo ▲ soluble ■ Inmovilizada
40
50
60
70
80
Temperatura
pH
100
Temperatura óptima ▲ soluble ■ Inmovilizada
Estabilidad con la temperatura a 50°C
90
Actividad Residual
Tabla1. Inmovilización de
Branchzyme®
Actividad Relativa
Caracterización
Inmovilización
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Tiempo (días)
▲ soluble ■ Inmovilizada
Aplicación
Capacidad de producir
azúcares reductores
100
75
50
25
0
1
5
9
13
17
21
Número de reusos
25
Reusos del derivado enzimático inmovilizado
Agradecimientos
Espectro MALDI-ToF MS de COS de alto PM obtenido
con la enzima soluble luego de 24 horas de
despolimerización
Conclusiones
Cromatograma CG-FID de la mezcla de COS luego de
24 hs de despolimerización enzimática
Branchzyme es una enzima homotetramérica con un peso molecular de 256 kDa.
Su punto isoeléctrico es de 5.3 y su rango de temperatura óptima es entre 50 y 60°C.
Fue posible su inmovilización con rendimientos de inmovilización de proteína y actividad de 67% y 17% respectivamente.
La inmovilización mejoró la estabilidad térmica de la enzima aumentando cinco veces su vida media y permitiendo su reuso por al
menos 25 ciclos consecutivos reteniendo un 40% de su capacidad inicial
El perfil de hidrólisis de quitosano obtenido fue similar para la enzima soluble e inmovilizada, obteniéndose COS con grado de
polimerización (DP) de entre 2 y 20 siendo mayor la concentración de aquellos con DP 2 , 3, 7 y 8.
Los resultados obtenidos confirman que la inmovilización de este tipo de quitosanasa a un soporte sólido representa un alternativa
útil al uso de la enzima en solución.
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