Geles de Polyacrilamida
Desnaturalizantes y Nativos
Visualización de proteínas purificadas
¿Qué saben de electroforésis en geles de polyacrilamida con SDS?
Sistema de buffer discontinuo:
Disociación de proteínas en subunidades por efecto del calor, SDS (detergente
aniónico) y un agente reductor (DTT o β-Mercaptoetanol).
La cantidad de SDS unida es proporcional a la masa molecular, por lo cual la
relación carga/masa = para todas las moléculas de proteína (la carga ppia es
despreciable).
Se llama Sistema de Buffer Discontinuo, y crea fronteras móviles creadas por
la corriente eléctrica.
Tanto la muestra como el stacking tienen Tris-HCl pH 6.8, mientras que el buffer
superior e inferior tienen Tris-Glicina pH 8.3, y el gel separador tiene Tris-HCl pH
8.8.
Cuando se aplica electricidad, los Cl- en la muestra y stacking forman el borde
lider de la frontera móvil, seguido de la muestra (carga -) y por atrás la glicina,
que a ese pH está en la forma zwitterionica (carga neta = 0)
Esta frontera móvil se va achicando, y por
ende se “stackean” las proteínas; cuando se
llega al gel separador, toda la proteína está
en una fina línea. Ahí es donde cambia el pH
a 8.8 en el gel separador, la glicina ahora
tiene carga (-) y ahora migra con el Cl- por
delante de las proteínas, que ahora tienen
vía libre para separarse por tamaño
La concentración de acrilamida:bisacrilamida va a determinar el tamaño del
poro, y este tamaño es el que va a crear resistencia al pasaje de las proteínas.
Dependiendo del porcentaje de acrilamida:bisacrilamida, la misma muestra va a
correr de manera diferente.
Nosotros vamos a hacer 2 geles, 1 nativo y otro desnaturalizante.
En el gel nativo, las proteínas se corren por su carga intrínseca (como tiene
que ser?), y se van a separar según esta carga y su tamaño, pero lo bueno es
que no están desnaturalizadas, entonces podemos ver una banda verde de
GFP iluminando el gel con luz UV en el transiluminador.
En el gel desnaturalizante, las proteínas van a separarse solo por su tamaño
(todas tienen carga negativa) y están desnaturalizadas, por lo cual GFP ya no
va a ser fluorescente, pero podemos ver todas las proteínas tiñiendo con
Coomassie.
Qué es lo que esperamos?
Corte Trombina
Eluido Glutation
GFP
GST + GST-GFP
¿Como se vería esto corriendo en un SDS-PAGE y tiñiendo con Coomassie?
¿Como se vería en un gel nativo y visto al UV? ¿Qué es cada banda?
Coomassie
Nativo
Tromb. Glut.
Tromb. Glut.
A TRABAJAR!
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