Práctica Enzimas de Restricción
Enzimas de restricción
 Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias
 Sistema inmune bacteriano destruye ADN que no es propio
 ADN bacteriano protegido por metilación. La enzima de restricción
corta el ADN no metilado: no propio
Enzimas de restricción
 Se han identificado cientos
 La mayoría reconocen y cortan
secuencias palindrómicas
 Muchas dejan “puntas
pegajosas”
 Se pueden hacer cortes muy
precisos del ADN al escoger la
enzima
 Importante en biología
molecular: puntas pegajosas se
unen con secuencia
complementaria
Palíndrome
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
oso
radar
reconocer
rotor
salas
seres
somos
sometemos
oro
ala
ojo
Secuencia palindrómica en biología
• Locus de ADN en el que la secuencia 5'-a-3'
es idéntica en ambas hebras
5'- G A A T T C -3'
3'- C T T A A G -5'
Algunas enzimas usadas
comúnmente
Eco RI
Eco RV
Hin D III
Sac I
Sma I
Xma I
5'-G | AATTC
5'-GAT | ATC
5'-A | AGCTT
5'-GAGCT | C
5'-CCC | GGG
5'-C | CCGGG
Bam HI
5'-G | GATCC
Pst I
5'-CTGCA | G
Uso de enzimas de restricción
•
La actividad depende de condiciones precisas:
pH
Temperatura
Concentración de sales
Iones
•
Unidad enzimática (u) es la cantidad de enzima
requerida para digerir 1 ug de ADN bajo condiciones
óptimas:
3-5 u/ug de ADN genómico
1 u/ug ADN de plásmido
Stocks típicamente 10 u/ul
Tipos corte
Utilidad para ADN recombinante
Marcador de peso molecular
• Permite identificar
tamaño (peso)
aproximado de
moléculas en un gel
• A menudo es ácido
nucleico digerido con
enzima de restricción
• Común: fago lambda
digerido con HindIII:
da 5 bandas
• O la escalera de 1kb
Plásmidos en gel
Electroforesis de plásmidos
• Plásmido sin cortar puede tomar
5 conformaciones
• No se puede determinar el
tamaño de un plásmido no cortado.
• Si se corta con ER que corte en
un sitio: se lineariza
pUWL201/EcoRI
pUWL201
pGEM-T/EcoRI
pGEM-T
Digestión plásmidos
Número bandas=
número de sitios
de restricción
Digestión ADN genómico
Diagnóstico deleciones/inserciones
por electroforesis
Deleción en FQ
Fibrosis quística
Recesiva
Deleción 3pb en gen CFTR, 70% de
casos
Degradada en RE, no llega a
membrana celular
Diagnóstico por sitios de restricción
Mutación Hemocromatosis
Mutación: Cys282Tyr
Mutación Hemocromatosis
Mutación: His63Asp
• http://www.protocolonline.org/prot/Research_Tools/Online_To
ols/Restriction_Digestion/index.html
Lambda cortado con EcoRI
5 cortes
Lambda cortado con Eco RI
6 fragmentos
Práctica
• Digestión del fago Lambda con tres enzimas de
restricción
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Laboratorio Enzimas de Restriccion II