Trabajo Práctico Nº4
Aislamiento de Microorganismos
Diversidad Metabólica
Objetivo del Trabajo Práctico
Aislamiento de microorganismos partir de
distintos inóculos (agua, ricota, arroz, tierra
y yogurt)
1)Enriquecimiento-Selección
2)Selección-Diferenciación
3)Obtención de un cultivo puro (Tinción de
Gram y Pruebas Bioquímicas)
Microorganismos a aislar:
•
•
•
•
•
•
Enterobacterias (agua)
Pseudomonas spp. (agua)
Staphylococcus spp. (ricota)
Bacillus spp. (arroz)
Lactobacillus spp. (yogurt)
Azotobacter spp. (tierra)
Medios de Cultivo: características generales
•Disponibilidad de nutrientes (C, N, sales inorgánicas,
vitaminas)
•Disponibilidad de oxígeno
•pH
•Humedad
•Temperatura
•Esterilidad
• Medios Definidos o Complejos
• Medios Mínimos (definidos) o Ricos
(complejos).
•Medio Definido: los componentes del medio (y sus concentraciones)
son conocidos.
Ejemplo de Medio Definido para Escherichia coli:
Componente
Gramos/litro
Glucosa
5
Fuente de C y
energía
Na2HPO4
6
Buffer, fuente de P
KH2PO4
3
Buffer, fuente de P
NH4Cl
1
Fuente de N
NaCl
0.5
Fuente de Na
MgSO4•7H2O
0.12
Fuente de Mg
CaCl2•2H2O
0.01
Fuente de Ca
•Medio Complejo: se agregan ingredientes cuya composición exacta de
desconoce (extractos, peptonas, etc).
Ejemplo de Medio Complejo para Salmonella:
Componente
Gramos/litro
Extracto de
carne
5
Fuente de aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y
micronutrientes. También fuente de C.
Peptona
6
Fuente de aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y
micronutrientes. También fuente de C.
Glucosa
5
Fuente de C y energía.
Na2HPO4•12H2O
4
Buffer y fuente de P.
FeSO4•7H2O
Indicador
Sulfito de
Bismuto
Verde Brillante
Ágar
0.3
Indicador de producción de H2S. Fuente de Fe
y S.
8
Inhibe el crecimiento de Gram positivos
0.025
Inhibe el crecimiento de Gram positivos
20
Peptonas: péptidos (aminoácidos libres), carbono y nucleótidos.
•Peptona de caseína (triptona): degradación pancreática de la
caseína.
•Peptona de carne: degradación pancreática de la carne.
•Peptona de gelatina: degradación pancreática de la gelatina.
•Proteosa peptona: peptona de mayor calidad, con alta proporción
de péptidos de menor PM, aminoácidos libres y factores de
crecimiento.
•Extracto de levadura: es la parte hidrosoluble de la levadura
autolizada. Alto contenido de vitaminas.
•Medio Mínimo: posee la mínima cantidad de nutrientes requeridos
para el crecimiento. Es un medio definido. Por ej.: M9.
•Medio Rico: posee gran variedad de nutrientes y en abundancia
(provenientes de extractos y peptonas). Por lo general son medios
complejos.
Por ej: Luria-Bertani (LB):
Componente
Gramos/litro
Triptona
10
Aminoácidos, carbono, energía, macro y
micronutrientes.
Extracto de
Levadura
5
Vitaminas, macro y micronutrientes.
NaCl
10
Balance osmótico.
•Medio de Enriquecimiento: se utiliza como primer paso en el aislamiento
de bacterias. Contiene sustancias que permiten enriquecer el cultivo en
el organismo de interés.
•Medio Selectivo: posee sustancias que permiten el crecimiento de un
grupo de bacterias y que inhiben el desarrollo de otros grupos. Por ej:
sales biliares y cristal violeta: inhiben el crecimiento de Gram
positivos.
•Medio Diferencial: contiene compuestos que permiten detectar algún
cambio de color en el medio cuando ocurre una determinada reacción
química. Por ej: azul de bromocresol: indicador que vira al amarillo
cuando el pH del medio es ácido (permite distinguir a las bacterias
que fermentan lactosa).
•Medio Selectivo y Diferencial.
Pasos a seguir para aislar un microorganismo (y caracterizarlo):
1.
Inocular la muestra (agua, tierra, yogurt, ricota o arroz) en
un caldo de enriquecimiento.
2. Incubar a la temperatura y tiempo adecuados.
3. Estriar en medio selectivo (además puede ser diferencial).
Obtención de colonias aisladas.
4. Tinción de Gram
5. Pruebas Bioquímicas: TP Nro. 5.
Enterobacterias
g-Proteobacteria
Bacilos Gram negativos
Fermentadores de glucosa
Anaerobios facultativos
Flagelos peritricos
Escherichia coli (algunas cepas patógenas)
Salmonella, Shigella, Enterobacter, Yersinia, Klebsiella,
Proteus, entre otros. Todos con especies patógenas.
 Oxidasa negativos







Aislamiento de Enterobacterias (agua)
1. Sembrar en Caldo Mac Conkey (2x): medio de enriquecimiento y
selectivo para el aislamiento de enterobacterias de agua y leche.
Peptona de Caseína
Lactosa
Bilis de Buey
Púrpura de Bromocresol
pH= 7,4±0,2
Incubar por 48 hs a 37ºC
Si hay fermentación de lactosa:
Sólo ácido
Gas + ácido
Coliformes, sin E. coli
E.coli (junto a otras coliformes)
Aislamiento de Enterobacterias (agua)
Crecimiento en
Caldo Mac Conkey
Cambio de
color a
amarillo
Formación de
Gas
Bueno
Sí
Sí
Bueno
Sí
Sí
Bueno
Sí
Sí
Proteus mirabilis
Bueno
No
No
Pseudomonas
aeruginosa
Malo
Staphylococcus
aureus
Malo
Escherichia coli
(lactosa +)
Enterobacter
cloacae
(lactosa +)
Klebsiella
pneumoniae
(lactosa +)
Si hay formación de gas y el pH del medio se acidifica, entonces, el
siguiente paso es estriar en ágar Mac Conkey y ágar EMB.
Aislamiento de Enterobacterias (agua)
2. Ágar Mac Conkey: medio selectivo y diferencial.
•Peptona de Caseína
•Peptona de Carne
•Cloruro de Sodio
•Lactosa
•Sales biliares
•Cristal violeta
•Rojo Neutro
pH= 7,1±0,1
Incubar por 24 hs
a 37ºC
Apariencia de las
colonias
Microorganismo
Grandes, rojas, con
halo
Escherichia coli (lactosa +)
Grandes, rosadas,
mucoides
Enterobacter spp., Klebsiella
spp. (lactosa +)
Incoloras,
transparentes
Salmonella spp., Shigella spp.,
Proteus spp.
Pequeñas, opacas,
aisladas
Enterococci, Staphylococci
Ágar Mac Conkey
Lactosa +
Escherichia coli
Lactosa -
Salmonella typhimurium
Aislamiento de Enterobacterias (agua)
2. Ágar EMB: medio selectivo y diferencial
(enterobacterias patógenas).
•Peptona de Carne
•Hidrógenofosfato dipotásico
•Lactosa
Apariencia de las
•Sacarosa
colonias
•Eosina Amarillenta
Transparentes, de color
•Azul de Metileno
ámbar
pH=7,0±0,2
Incubar por 24 hs
a 37ºC
Microorganismo
Salmonella spp., Shigella spp.
Verdosas con brillo
metálico a la luz
reflejada, con el centro
negroazulado a la luz
transmitida
Escherichia coli (lactosa +,
Más grandes que las de
E. coli, mucosas,
confluentes, con el
centro pardo-grisáceo a
la luz transmitida
Enterobacter spp., Klebsiella
spp. (lactosa+, sacarosa-)
sacarosa +)
Ágar EMB
Lactosa +
Escherichia coli
Lactosa +
Enterobacter spp.
Pseudomonas spp.








g-Proteobacteria
Bacilos Gram negativos
Aerobios estrictos
Con flagelos polares
Producen pigmentos
No fermentadores
Oxidasa positivos
Patógenos de plantas/infecciones oportunistas en humanos
Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa (agua)
1.
Sembar en Caldo M9 (2x) e incubar por 48 hs a 42ºC:
enriquecimiento y selección.
2. Estriar en Ágar Cetrimida: medio selectivo para Pseudomonas
aeruginosa
•
•
•
•
•
Peptona de Gelatina
MgCl2
Cetrimida
Glicerina
SO4K2
Incubar por 48 hs a 37ºC.
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus spp.
•
•
•
•
•
•
Cocos Gram positivos
Anaerobios facultativos
Fermentan glucosa (ac. láctico)
Asociados a piel y mucosas
Patógenos (S. aureus)
Resisten altas concentraciones salinas
Aislamiento de Staphylococcus aureus (ricota)
1.
Ricota en Agua Peptonada: enriquecimiento (2 hs a temperatura
ambiente)
2.
Mezclar con Caldo Cerebro Corazón (con NaCl 13%): medio selectivo
para Estafilococos patógenos.
•
Infusión de cerebro
•
Infusión de corazón
•
Proteosa peptona
•
D(+) Glucosa
•
NaCl (7.5% final)
•
Hidrógenofosfato disódico
pH=7,4±0,2
Incubar por 48 hs a 37ºC
Si hay crecimiento, estriar en Ágar manitol salado-rojo fenol y Ágar azida
Aislamiento de Staphylococcus aureus
3. Ágar manitol salado-rojo fenol: medio selectivo y diferencial (permite
distinguir entre S. aureus y otras especies no patógenas).
•
Peptona de carne
•
Extracto de carne
•
NaCl 7.5%
•
D(-)Manitol
•
Rojo fenol
pH=7,4±0,2
Apariencia de las colonias
Microorganismo
Con halo amarillo,
luminoso; crecimiento
intenso
Manitol-positivos: S.
Sin cambio de color; poco
crecimiento
Manitol-negativos: S.
epidermidis y otros.
aureus
Incubar por 48 hs a 37ºC
1.
2.
3.
S. aureus
S. epidermidis
Micrococcus luteus
3. Ágar azida: medio selectivo para Staphylococcus spp.
Incubar por 48 hs a 37ºC
Bacillus spp.
•
•
•
•
•
•
Bacilos Gram positivos
Forman endosporas
Generalmente móviles con flagelos peritricos
Aerobios (facultativos)
B. cereus (alimentos)
B. anthracis
Aislamiento de Bacillus cereus y Bacillus subtilis (arroz)
1.
2.
3.
4.
Arroz en PBS (80ºC por 5 min.): selección.
Pasar el sobrenadante a caldo nutritivo: enriquecimiento.
Incubar por 48 hs a 37ºC.
Estriar en Ágar Mossel con emulsión de yema de huevo: selectivo y
diferencial (permite distinguir entre Bacillus cereus y B. subtilis)
•
•
•
•
•
•
Peptona de carne
Extracto de carne
D(-)Manitol
NaCl
Rojo Fenol
Emulsión de yema de huevo/Polimixina B
Incubar por 48 hs a37ºC.
Bacillus cereus: colonias rugosas, secas, de color rosado y rodeadas de precipitado
blanco (Manitol – y lecitinasa +).
Bacillus subtilis: colonias amarillas y sin precipitado (Manitol + y lecitinasa -).
Lactobacillus spp.
• Bacilos o cocobacilos Gram positivos
• Fermentadores lácticos
• Aerobios facultativos o microaerófilos
Aislamiento de Lactobacillus spp. (yogurt)
1. Ágar De Man, Rogosa y Sharpe (MRS): medio de enriquecimiento
selectivo.
Polisorbato, acetato, magnesio y manganeso.
pH = 5.7.
Incubación en microaerobiosis.
2. Ágar Rogosa: medio más selectivo que el
anterior, con mayores concentraciones de
acetato y pH = 5.5 que inhiben flora
acompañante.
Incubación en microaerobiosis.
Ágar MRS-Lactobacillus casei
Azotobacter spp.
•
•
•
•
•
Bacilos o cocos Gram negativos
Habitan en el suelo y en el agua
Fijan nitrógeno atmosférico (N2 a NH3)
Vida libre
Forman quistes (similar a endosporas)
Medio Fred & Waksman: medio selectivo sin fuente de
nitrógeno. Contiene manitol (azúcar fermentable).
Crecimiento a 28ºC.
Microorganismo
Enriquecimiento
-Selección
SelecciónDiferenciación
Agua
Enterobacterias Caldo Mc
Conkey
Ágar Mc Conkey
y ágar EMB
Agua
Pseudomonas
Caldo M9-42ºC
Ágar Cetrimida
Ricota
Staphylococcus
Caldo cerebrocorazón con
7.5% NaCl
Ágar manitol
salado rojo
fenol y ágar
azida
Arroz
Bacillus
80ºC y caldo
nutritivo
Ágar Mossel con
emulsión de
yema de huevo y
PmB.
Yogurt
Lactobacillus
Ágar MRS
Microaerobiosis
Ágar Rogosa
Microaerobiosis
Tierra
Azotobacter
Caldo Fred&
Waskman-28ºC
Ágar Fred &
Waskman-28ºC
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