PRÁCTICO N° 3
Técnicas para la observación, aislamiento
y conservación de microorganismos
Objetivo: Adquirir habilidad para el manejo de colorantes,
microscopio, condiciones de asepsia y métodos de
aislamiento
1) Métodos de coloración y observación de microorganismos
2) Manejo en condiciones de asepsia
3) Obtención de cultivos puros
4) Conservación de cultivos puros
Síntesis del práctico 1
Práctico
1
Esterilización
Laboratorio
Medio de cultivo
Práctico
2
Observación
Aislamiento
• Autoclave- horno
• Radiación
• Filtración
• Productos químicos
Composición química
• Fuente de energía/carbono
• Base mineral
• Agua
Preparación de medios
Líquidos
Sólidos
• Pesar drogas
• Disolver con agua destilada
• Regular pH
• Fraccionar
•
•
•
•
•
•
Pesar drogas
Disolver con agua destilada
Regular pH
Agarizar
Fundir
Fraccionar
Esterilización en autoclave
Siembra de suelo
Incubación
Métodos de coloración y observación de microorganismos
Características del microscopio óptico
Aumento: objetivo x ocular
Resolución: objetivo de inmersión (aceite de inmersión)
Tipos de microscopios
Campo claro
Contraste de fases
Campo oscuro
Fluorescencia
Métodos de coloración
Objetivo: Aumentar el contraste de los microorganismos con el fondo
Tipos de coloración:
• Simples (un solo colorante)
• Dobles (dos colorantes, coloraciones diferenciales)
Colorantes más utilizados:
• Safranina
• Azul de metileno
• Fucsina
• Cristal violeta
• Azul de algodón
Manejo en condiciones de asepsia
Atmósfera:
cámara de flujo, lámpara UV
Superficie de la mesa de trabajo:
alcohol, hipoclorito
Obtención del material:
ansa estéril
Flameado de recipiente
Secuencia de una coloración
Preparación y fijación de
un extendido por calor
Coloración
Observación
Secuencia de una coloración simple
Equipo de coloración
Extraer una alícuota
Flamear un portaobjeto
Extender
Esterilizar el ansa
Fijar al calor
Secuencia de una coloración simple (cont.)
Esperar un minuto
Agregar el colorante
Lavar
Secar
Observar
Secuencia de una coloración simple (fijación con ácido)
Portaobjeto enterrado
Colorear con fucsina
Esperar 5 minutos
Fijación con ácido acético
Actividad: colorear con fucsina los cultivos de suelo (fijado por calor) y el
portaobjeto enterrado (fijado con ácido acético).
Coloración simple (Rossy-Cholodny)
Hongo
tabicado
Partícula de
arena
Bacterias
Actinomycetes
Hongos
Coloración doble (Gram)
1) Teñir el extendido con Cristal Violeta (1 minuto)
Todas las bacterias se tiñen de violeta
2) Añadir Lugol para fijar el colorante (1minuto)
3) Decolorar con alcohol
Las bacterias G + quedan violetas y las G – se decoloran
4) Teñir con fucsina (30 segundos)
Las bacterias G + quedan violetas y las G – rosadas
Coloración doble (Gram)
Actividad: observar al microscopio bacterias Gram + y Gram –
Bacterias G-
Bacterias G+
Obtención de cultivos puros
Cultivo puro: cultivo de microorganismos genéticamente iguales.
Aislamiento: Método para obtener un cultivo puro.
Métodos de aislamiento
Aislamiento en medio sólido:
Consiste en separar e inmovilizar
individuos en un medio solidificado.
Aislamiento biológico:
Consiste en inocular animales o
vegetales y aislarlas de la sangre,
tejidos, etc.
Obtención de cultivos puros
Aislamiento en medio sólido por estriado
Colocar en caja de Petri
Dejar solidificar
Fundir el agar
Esterilizar el ansa
Trazar estrías sobre el agar
Incubar
Obtención de cultivos puros
Actividad 1: realizar estrías en superficie.
Actividad 2: observar estrías en caja de Petri y cultivos puros en
pico de flauta
Colonias aisladas
Crecimiento confluente
Cultivos puros en caja de Petri
Conservación de cultivos puros
Formas de conservación de cultivos puros
• Liofilización: desecación mas congelación
• Congelación: -90° C recubierto con glicerol
• Subcultivos seriados: repiques
periódicos ( 4-5°C)
Síntesis del práctico N° 3
Técnicas
microbiológicas
Observación
Microscopio Óptico
Tipos:
• Campo Claro
• Contraste de Fase
• Campo Oscuro
• Florescencia
Coloración tipos
•Simples
•Dobles
Aislamiento
Normas de manejo
en microbiología
Conservación
• Medio sólido (estrías)
Liofilización
• Biológico (vegetales o
animales)
Congelación
Subcultivos seriados
Asepsia
Atmósfera
Sup. de trabajo
Manejo de material
y recipiente
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