Dr. José A. Cardé-Serrano
Laboratorio Biol 4019 – Biol Celular
Universidad de Puerto Rico - Aguadilla
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Luego de haber completado el ejercicio, el (la)
estudiante estará capacitado para:
Explicar las funciones de las endonucleasas de
restricción.
Especificar las ventajas de las endonucleasas
de restricción cuando son utilizadas para el
estudio del DNA.
Enumerar las diversas aplicaciones en el uso de
las endonucleasas de restricción.
Crear y analizar patrones polimórficos de
endonucleasas de restricción.
En los últimos años la biología molecular ha
revolucionado el estudio de los ácidos nucleicos, en
particular el DNA.
 El conocimiento de la estructura del DNA y el desarrollo
de la tecnología de DNA recombinante han permitido la
manipulación del material genético en cualquier tipo
de célula.
 La tecnología de manipulación genética ha sido
aplicada desde bacterias hasta organismos eucariota
(e.j. tomate, maíz y peces).
 La manipulación genética se ha logrado en gran parte
por el uso de las endonucleasas de restricción.
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A. Endonucleasas de restricción.
Enzimas que reconocen una secuencia específica de
nucleótidos y producen un corte en el lugar de
reconocimiento o muy cerca del mismo.
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Las bacterias poseen las endonucleasas de restricción
como un sistema enzimático de defensa en contra de la
invasión de DNA exógeno, como por ejemplo; el ataque
de un bacteriófago.
Descubiertas por Stewart Lynn y Werner Arber
en 1960 en la bacteria Echerichia coli.
 Se speraba que esta cortara cualquier DNA en
una secuencia de nucleótido específico
 No ocurrió como ellos esperaban, la enzima no
cumplió con sus expectativas.
 Más adelante, Hamilton Smith descubrió una
endonucleasa de restricción en la
bacteria Haemophilus influenza sepa Rd (figura
1), llamada HindII.
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La primera letra del nombre de la enzima proviene
del género
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Las próximas dos letras de la especie
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La cuarta letra de la sepa.
El número romano hace referencia a la cantidad de
endonucleasas de restricción que han sido extraídas
de la misma bacteria.
 Ejs. HindI, HindII y HindIII.
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La secuencia de reconocimiento para la
mayoría de estas endonucleasas de restricción
contiene de 4 a 6 y hasta 8 nucleótidos.
Esta secuencia de reconocimiento exhibe una
simetría palindrómica, lo que quiere decir,
aunque no implica eso, que lee lo mismo de”
izquierda a derecha que de derecha a
izquierda”.
Ejemplo: 5’ GGGCCC 3’
3’ CCCGGG 5’
• Las enzimas que reconocen una secuencia de 4 bases,
cortan con más frecuencias que las que reconocen una
secuencia de 6 bases
• La frecuencia esta determinada por la probabilidad:
• Una secuencia de 4 bases tiene la probabilidad de ocurrir
en un genoma cada 256 pb (44 = 256)
• Una secuencia de 6 bases tiene la probabilidad de ocurrir
en un genoma cada 4,096 pb (46 = 4096).
• Una secuencia de 8 bases tiene la probabilidad de ocurrir
en un genoma aproximadamente cada 65,000 pb (48 ≈
65,000).
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Enzimas que reconocen la misma secuencia pero
cortan en lugares distintos del mismo palindrome
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Ejemplo:
XmaI C↓CCGGG
SmaI CCC↓GGG
Endonucleasa de restricción Secuencia de
reconocimiento
AluI
AG↓CT
BamHI
G↓GATCC
EcoRI
G↓AATTC
HaeIII
GG↓CC
HindII
GTPy↓PuAC
HindIII
A↓AGCTT
PstI
CTGCA↓G
HpaII
C↓CGG
NotI
GC↓GGCCGC
Terminales truncados: enzimas cortan ambas hebras del
DNA en el mismo punto (HaeIII)
 Terminales pegajosos: enzimas que cortan las hebras de
DNA en una forma escalonada, dejan fragmentos con cierta
capacidad de complementaridad (EcoRI)
 el fragmento sencillo de la hebra pueden parearse a través
de enlaces de hidrógenos a las bases de otro fragmento
sencillo generado por la misma enzima.
 Estas ultimas son usadas para crear moléculas de DNA
recombinante (ver aplicaciones de endonucleasas de
restricción).
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B. Metilación y actividad de las endonucleasas de
restricción
Las bacterias poseen un sistema para proteger su propio
DNA de la digestión por parte de sus endonucleasas de
restricción, o sea reconocen su propio DNA del DNA
exógeno.
 Las bacterias poseen en su DNA unas bases metiladas que
no le permiten a la endonucleasa reconocer la secuencia
donde corta.
• La presencia de bases metiladas no siempre
protege al DNA de ser cortado; ciertas enzimas
solo reconocen secuencias que contienen bases
metiladas.
• Durante la replicación del DNA sola la hebra
parental (que ha servido como molde) se
encuentra metilada, lo que se conoce como
hemimetilada.
• Esta hemimetilación es suficiente para proteger la
doble hélice del DNA de ser cortado por la
endonucleasa de restricción
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Antes del próximo ciclo de
replicación la hebra nueva
debe ser metilada por la
enzima conocida
como metilasa (figura 3).
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C. Aplicaciones en el uso de las endonucleasas de restricción.
Entre estas se encuentran: ingeniería genética, pruebas de
paternidad o maternidad y medicina forense, entre otras.
1) Ingeniería genética.
 A través de la tecnología de DNA recombinante cualquier segmento
de DNA puede ser separado de un genoma y ligado a un genoma de
otro individuo.
 Esta tecnología que se comenzó a utilizar con bacterias, les ha
permitido a los investigadores estudiar con más precisión los genes
de organismos procariota y eucariota.
Enzimas de Restriccion – animación
La clonación es la técnica central de la tecnología de
DNA recombinante.
 permite replicar (clonar) en grandes cantidades un
pedazo específico de DNA.
 El DNA de interés es cortado y ligado a un elemento
genético, vector de clonación, que se puede replicar
autónomamente cuando se introduce a una bacteria
en crecimiento, en la mayoría de los casos E. coli.
 El vector de clonación puede ser un plásmido o
un bacteriófago.
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Tanto el DNA de interés como el
vector de clonación deben ser
cortados con la misma enzima.
Las enzimas más utilizadas en esta
técnica son aquellas que producen
terminales pegajosos. En esencia,
dos fragmentos de DNA generados
por la misma endonucleasa de
restricción pueden unirse por el
pareo de las bases complementarias
en los fragmentos sencillos de cada
terminal.
•
Primero se corta el DNA de interés
y el vector de clonación con la
misma endonucleasa de
restricción para generar
terminales pegajosos.
•
Luego se mezclan los fragmentos
bajos las condiciones apropiadas
para que las bases en los
terminales se puedan unir.
•
Ya unidos los fragmentos, se le
añade DNA ligasa para que esta
una covalentemente esos
fragmentos.
2) “DNA fingerprinting”
Los análisis de los patrones formados por los fragmentos
que se producen cuando el DNA es cortado por las
endonucleasas de restricción han sido utilizados,
 para estudiar en detalle los genomas de diversos
organismos,
diagnosticar enfermedades genéticas
 resolver crímenes violentos.
Estos análisis tienen como base el hecho de que dos
personas que no son gemelos idénticos poseen diferente
secuencia de nucleótidos en el DNA.
Aunque la diferencia en la secuencia de bases en el DNA
entre dos personas sea pequeña, los fragmentos
producidos por las endonucleasas de restricción son de
diferentes tamaños.
 Esta diferencia en el tamaño de los fragmentos,
conocido como patrones polimórficos de
endonucleasas de restricción (restriction fragment
length polymorphisms, RFLP’s), pueden ser analizados
por electroforesis
 Los resultados en los patrones son distintivos para cada
persona, por lo que funcionan como huellas dactilares
(“DNA fingerprinting”).
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En la práctica solo una pequeña fracción de las bandas
producidas por los fragmentos de restricción son
examinadas.
La figura 3 ilustra el proceso de “DNA fingerprinting”
para determinar un caso de paternidad.
En el primer paso se extrae DNA de la madre, del niño y
del alegado padre.
El DNA de las tres personas se somete a digestión con
endonucleasas de restricción.
Los fragmentos resultantes son separados utilizando
electroforesis en geles de agarosa.
Como el genoma de cada persona es tan grande,
miles de bandas son generadas y son muy difíciles de
ver en el gel.
 Para resolver este problema se utiliza la técnica
principal del “DNA fingerprinting” conocida
como “Southern blotting” (Figura 5 a).
 En la misma, una membrana de nitrocelulosa es
presionada sobre el gel permitiendo que el patrón de
bandas de DNA transfiera del gel a la membrana.
 Luego se le añaden sondas radioactivas a la
membrana.
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Las sondas son fragmentos radioactivos de DNA o
RNA complementarios al DNA de interés.
Las sondas se unen al DNA complementario por
medio del pareo de las bases.
Las bandas a las cuales las sondas se han unido se
hacen visibles por medio de radiografía.
Los resultados observados en la figura 5 b indican que
el alegado padre es el verdadero padre del niño.
El mismo procedimiento es utilizado en casos de
asesinato y/o para determinar si un individuo es
portador de una enfermedad genética.
Materiales
Agua destilada
Amortiguador 10 X (específico para cada endonucleasa de
restricción)
 Baño de agua
 Endonucleasas de restricción
 Hielo
 Micropipetas
 Microtubos de 0.5 ml
 Puntas para micropipetas
 RNAsa
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Soluciones
Amortiguador 10 X*
RNAsa 10 mg/ml
DNA
Endonucleasa de restricción**
Agua destilada
Cantidades
2.5 µl
0.5 µl
10 µg
10 unidades
Añada para completar un
volumen de 25µl
* Es específico para cada endonucleasa de restricción.
Asegúrese de mantener el
amortiguador 10 X todo el tiempo en hielo.
** A cada grupo de trabajo se le asignará una endonucleasa
de restricción distinta.
Asegúrese de mantener la endonucleasa de restricción
todo el tiempo en hielo.
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1) En un microtubo de 0.5 ml mezcle:
2) Coloque el microtubo con la digestión
preparada en el paso 1 en un baño de María a
37 ºC.
3) Luego de una hora remueva el microtubo
del baño de María y guárdelo a –20º C hasta
el próximo laboratorio.
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Explique como la metilación actúa para proteger el DNA de
la acción de las endonucleasas de restricción.
Explique en términos biológicos porque la metilasa
evolucionó en las bacterias.
Teniendo en cuenta la endonucleasa con la que usted
trabajó, ¿espera usted que se complete todo el proceso de
restricción del DNA de E. coli o Aedes aegypti? Explique su
respuesta.
¿Por qué la digestión con las endonucleasas de restricción se
lleva acabo a 37 ºC?
Mencione, explique y de ejemplo de una aplicación en el uso
de las endonucleasas de restricción que no haya sido
explicada en este módulo.
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Lab5_Enzimas Restriccion_UPRAg