Electroforesis
La electroforesis es una técnica que se basa en la separación de moléculas
según la movilidad de estas en un campo eléctrico.
Tipos:
De frente móvil (en solución)
De zona (sobre un medio soporte)
En papel
Sílice
Geles (a través de una matríz porosa)
Agarosa
Poliacrilamida
(DNA)
(DNA y proteínas)
v
Fel
Cátodo
Ánodo
-
Fel = Q . E = Q . V/d
Fresist = f . v
A v constante
+
Fresist
Q = carga
E = potencial eléctrico
V = voltaje
d = distancia entre electrodos
f = coeficiente de fricción
v = velocidad
Fresist = Fel
Tamaño y forma
de la partícula
v partícula = Q . E
f
Movilidad de la partícula
m=v=Q
E
f
La movilidad del DNA depende de:
Factores extrínsecos a la partícula
[agarosa] o [poliacrilamida]
Voltaje
Buffer
Tiempo
Temperatura
pH
Factores intrínsecos a la partícula
Relación carga/masa
Conformación
Tamaño
Factores extrínsecos
Log(PM o Kbs)
[ ] Agarosa
% de agarosa
0,5%
0,7%
1%
a
b
mb>ma
m
1,2%
A > % de agarosa la movilidad de la partícula disminuye
A > % de agarosa la resolución de partículas de PM similar aumenta
% agarosa
Rango separación
poliacrilamida
1-5 pb a 500 pb
0,5
700 pb a 25 Kpb
0,8
500 pb a 15 Kpb
1
250 pb a 12 kpb
1,2
150 pb a 6 kpb
1,5
80 pb a 4 kpb
* Fragmentos grandes de DNA se corren en
geles de agarosa de campo pulsante
Poliacrilamida
=
Agarosa
Alta resolución
Baja resolución (poros grandes)
NO para fragmentos grandes
SI fragmentos grandes
Difícil de armar
Fácil de armar
Si el % es muy bajo el gel es frágil
Voltaje aplicado
V típico = 10 V / cm de gel
y geles de 10 – 15 cm
Mejor resolución
Voltajes menores (70 V)
(máxima resolución fragm. > 2kb, se corre a 5 V / cm de gel)
OJO,
V
difusión
100 V – 130 V
Buffer de corrida
Da la fuerza iónica al medio de corrida
Al
la [ ] de iones,
Composición
la resolución
TAE
Más usado. No puede reciclarse mucho.
TBE
Mayor capacidad buffer
TPE
Tiempo
Depende del tamaño de los fragmentos a separar
A
tiempo
resolución
OJO! (Que no se caiga la muestra del gel)
Temperatura
A
V
Temperatura y la m
OJO! (Se puede fundir el gel)
pH
Hay que controlar el pH
Evitar modificaciones en la carga y
conformación del DNA y las proteínas
Factores intrínsecos
Relación Q/m
Imp. para proteínas:
m
Q/m
Ac. Nucleicos: Q/m constante!
Tamaño
tamaño
m
Conformación del DNA
DNA circulares: 3 conformaciones posibles
CA
Circular abierto
Lineal
CCC
Circular covalentemente cerrado
(superenrrollado)
+
0,6 a 1% agarosa
Si el % de agarosa es de 1 a 1,4 % corren: 1ro. el Lineal, 2do. el CCC y 3ro. el CA
Glicerol o ficol o sacarosa
Densidad a la muestra
Loading Buffer
Colorantes de corrida
(ubicar frente de corrida)
Azul de bromofenol
(corre como DNA 300 pb)
Xylene Cyanol
(corre como DNA 4000 pb)
Orange G
(corre como DNA 50 pb)
Revelado
Autorradiografía
DNA marcado radioactivamente
(Ej. PCR radioactiva)
BrEt
(tumorigénico)
- Se intercala cada 2,5 pb
- Fluoresce naranja a la luz UV
- Detecta hasta 10ng de DNA ds
- En la agarosa o post-corrida
Genera SC(+). Afecta movilidad CCC.
Retrasa 15% lineal
Visualización durante corrida
Agentes
intercalantes
SyBR Gold
- Fluoresce amarillo
- Poca afinidad gel (bajo background)
- Detecta hasta 20 pg DNA ds
- Seguro (no tumorigénico)
- Caro
sintéticos
cualitativos
Marcadores de peso molecular
cuantitativos
DNA fagos o
plásmidos
digeridos por ER
Sintéticos
comerciales
Cuantificación DNA
Marker Lambda EcoR1/HindIII
Muestra
Tamaño DNA fagol = 48,5 kb
48,5 kb
3,53 kb
Intensidad
similar
100%
7,28%
Si sembré 500 ng marker DNA:
100%
7,28%
500 ng
36,4 ng
% por el vol de DNA
muestra sembrado
para obtener la [ ]
Tipos de geles de agarosa
Analíticos
Comunes
Preparativos
Alcalino (c/NaOH)
Para cDNA
Para RNA
Con formaldehído (desnaturaliza RNA)
PGFE (en campo pulsante)
Separación de fragm. > a 50 kb
Recuperación del DNA del gel
- Agregar al gel membrana de DEAE-celulosa
- Colocar trozo de gel en bolsa de diálisis
- Kits de sílica gel
- Usar low melting point agarosa (funde entre 25-35 grados). Extracción con fenol.
- Corte en gel durante la corrida, seguir con UV y levantar cuando DNA
cae en el pocillo
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Clase Electroforesis