Reacción de ligación:
Requieren de ATP y Mg++
T4 DNA ligasa
Extremos cohesivos > extremos romos
Liga oligos DNA y RNA a híbridos DNA-RNA
DNA Ligasa de E. coli
Muy baja eficiencia extremos romos
No liga RNA a DNA.
Reacción de ligación:
Inserto derecho, inserto invertido, concatémeros de inserto
Corte son 1 ER:
Vector + inserto
Vector religado
Vector-Vector
Defosforilación del vector
Relación molar inserto-vector
Clonado direccionado
• Relación molar
Plásmido aprox 7 Kb
Fragmento aprox 1.2 Kb
Relación 5.8 veces
Colocando 50 ng de vector
Fragmento 50: 5.8= 8.6 ng para relación 1:1
TRANSFORMACION Y SELECCION
TRANSFORMACION
Bacterias competentes:
Métodos químicos: Cl2Ca, DMSO, etc
Eficiencia:107 cel/mg DNA
Métodos físicos: Electroporación (pulsos electricos )
Ef: 108cel/mg DNA
SELECCIÓN
Presión de selección : crecimiento en presencia de
antibiótico
Transformación química
Controles
• Bacterias en medio con antibiótico (viabilidad)
• Bacterias en medio sin antibiótico (resistencia)
• Ligación vector sin ligasa (vector no cortado)
• Ligación vector solo con ligasa (vector no
cortado y vector cortado con una sola enzima)
• Vector cerrado de concentración conocida
(eficiencia de transformación)
Transformación electroporación
Electroporación
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Clase ligación competentes