ANALISIS DEL
POLIMORFISMO GENETICO
Proyecto Genoma Humano
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El proyecto Genoma Humano (HGP) se inició en 1990 y
fue completado en 2003, fue coordinado por
U.S. Department of Energy
National Institutes of Health
Wellcome Trust (U.K.) en los primeros años
Otras contribuciones desde Japon, Francia, Alemania,
China, y otros.
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml
Beneficios del Proyecto Genoma
Humano en Medicina
• Mejor diagnóstico (dx temprano, específico) de
enfermedades genética e infecciosas
• Detección temprana de mayor susceptibilidad a
enfermedades
• Mejor diseño de drogas
• Terapia génica y desarrollo de sistemas de control de
drogas
• Farmacogenómica
Análisis del Polimorfismo
• RFLP - restriction fragment length polymorphism
(Polimorfismo de la longitud de fragmentos de
restricción).
• AFLP - amplified fragment length polymorphism
• RAPD - random amplification of polymorphic DNA
• VNTR - variable number tandem repeat
• SSR - simple sequence repeat
RFLP
• RFLP - restriction fragment length polymorphism
(Polimorfismo de la longitud de fragmentos de
restricción).
• Tecnologia mas antigua
• Diferencia entre secuencias de DNA en la que un
DNA presente una secuencia de restricción que el
otro DNA no presenta.
• Los sitios de restricción son polimorficos
RFLP
Procedimiento:
• Corte con enzimas de restriccion
• Separacion por electroforesis
• Transferencia de DNA a filtro (Southern)
• Hibridación sobre filtro: La sonda utilizada debe
reconocer la secuencia donde se encuentra el sitio de
restricción
LA ANEMIA FALCIFORME ES CAUSADA POR UNA
MUTACION PUNTUAL
DNA
CCT-GAG-GAG
Proteína
Pro - Glu - Glu
DNA
CCT GTG GAG
Proteína
Pro - Val - Glu
GEN NORMAL (Hb A)
GEN MUTANTE
Anemia Falciforme (Hb S)
Enzima de Restricción utilizada : Mst I
RFLP Analysis
RFLP Analysis
PCR – RFLP
1. PCR – se obtiene la secuencia target
(OJO: aún cuando se obtenga un producto de
tamaño definido, no necesariamente la secuencia
de los productos es la misma)
2. Digestión con enzimas de restricción
3. Electroforesis en gel
4. Transferencia e hibridación con sondas específicas
si es necesario
RAPD
• Random amplification of Polymorphic DNA
(amplificación al random de DNA polimórfico)
• Primers de 10 bases
• 1 primer por reacción
RAPD
Template
DNA
 Los primers se unen a varios sitios en el DNA
templado
 Sólo cuando los primers se hayan unido en sitios
cercanos y estén orientados en direcciones
opuestas, ocurrirá la amplificación
RAPD
Template
DNA
Primers apuntan
hacia afuera,
entonces no
ocurrirá la
amplificación
RAPD
Template
DNA
Primers apuntan a la
misma dirección,
entonces la
amplificación no
ocurrirá.
RAPD
Template
DNA
> 2,000 bases
Primers están muy
alejados, entonces
la amplificación no
ocurrirá.
RAPD
Template
DNA
100 - 1,500 bases
Los Primers están a
una distancia
apropiada, ocurrirá
la amplificación
VNTR
• VNTR ( Variable Number of Tandem Repeats):
Repeticiones en tandem de número variable.
• Secuencias cortas (10 - 100 bp) repetidas dentro de
los sitios de restricción (si el análisis se hace por
RFLP), o los sitios donde se anclan los primers (si el
análisis es por PCR).
VNTR Analysis
Sitio de
restricción
Repeticiones en tandem
(Tandem Repeats)
Sitio de
restricción
4 repeticiones
9 repeticiones
17 pb
VNTR Analysis
SNPs
SNPs : Single nucleotide polymorphism
(polimorfismo dado por la diferencia en un solo
nucleótido)
Detección por PCR : primers diseñados con la misma
secuencia pero con la ultima base (extremo 3’) cambiada
según el polimorfismo que se quiera detectar.
DNA Templado 3´
5´
5´
3´ primer
La DNA polimerasa no puede iniciar aquí
la extensión de la nueva cadena
SECUENCIAMIENTO DE DNA : Metodo de Sanger
(uso de dideoxynucleótidos: ddNTPs)
Se realizan 4 reacciones por separado, los
productos de cada tubo se visualizan en gel.
Figure 7-29a
Uso de dideoxynucleótidos en el secuenciamiento marcados
con agentes fluorescentes
APLICACIONES
- Análisis evolutivo de especies relacionadas
- Determinación de relaciones de filiación
- Determinación de marcadores asociados con
virulencia o alguna caracteristica fenotípica (pero no
significa causalidad)
- Determinación de polimorfismos que causan una
enfermedad (dependiendo de dónde ocurre el
cambio)
Región en el DNA
no transcrita
upstream
Inicio de Transcripción
+1
downstream
GEN
Met-Lys-Ala- pppAAGUCACGUAAAGGGUAUCGACAAUGAAAGCAAU...
Región transcrita pero
no traducida
5´ UTR (untranslated region)
Inicio de Traducción
Región promotora
5´UTR
Secuencias repetitivas simples
1. DNA satélite: 5-500 pb en tándem (extensiones en el
orden de las megabases, ~ 106 pb)
Centrómero
2. DNA minisatélite: 5-100 pb en tándem (~ 103-105 pb)
Conservado: telómeros
Hipervariable (longitud): cerca de telómeros
→ identificación de individuos (“fingerprint”)
3. DNA microsatélite: 1-5 pb en tándem (10-40 pb)
Distribuidos de manera uniforme
Longitud variable → relaciones filogenéticas
Uso de minisatélites hipervariables en la
identificación de individuos
1. Digestión de DNA con
enzimas de restricción
2. Separación de fragmentos
por electroforesis
3. Transferencia de DNA a
membrana
4. Hibridación con sonda con
secuencia de minisatélite
marcada radioactivamente
Análisis de polimorfismo de tamaño de
cromosomas en Leishmania
• Comparación por PFGE del tamaño de
cromosomas en cepas y aislamientos de
pacientes de diferentes regiones del Perú
• Variación de tamaño por amplificación
/eliminación de genes ribosomales repetidos
en tándem:
Polimorfismo en cromosoma que contiene los genes
ribosomales en Leishmanias del complejo Viannia.
EJERCICIO
Usted desea determinar por
PCR si un paciente es portador
del gen de la anemia falciforme.
Indique:
a) dónde ubicaría los primers
a usar
b) cuál sería el procedimiento a
seguir
c) cómo espera usted que sean
los resultados
Descargar

Components of a PCR and RAPD Reactions