Marcaje molecular por sonda.
Presenta: Elier soto.
Objetivos de aprendizaje
 Explica los procedimientos para el marcaje
de fragmentos de DNA utilizando la
tecnología de PCR.
 Reconoce los tipos y características de
sondas moleculares y los fundamentos del
marcaje, asi como la importancia de su
utilización.
 Conoce y explica generalidades de
diferentes métodos de marcaje.
Errores mas frecuentes.
 La mala traducción de algunos libros de
textos, tienden a cambiar la idea general de
los conceptos.
 Confundir las técnicas de los distintos tipos
de marcaje molecular.
 No saber de donde proviene el fragmento
de Klenow.
 Casarse con la idea de que solo existe un
solo tipo de marcaje de DNA por sonda
¿Qué es una sonda de DNA?
 Son moléculas de DNA de cadena sencilla
marcadas mediante radiación o agentes
químicos, con el fin de ser utilizadas para la
detección de secuencias complementarias
de DNA.
Importancia.
 La capacidad de encontrar en un genoma
las secuencias de DNA de interes mediante
sondas especificas siendo usado
principalmente en el campo de la medicina.
marcaje de fragmentos de DNA
utilizando la tecnología de PCR.
 Se usan nucleotidos modificados con
moleculas fluorescentes o atomos
radiactivos (la molecula fluorescente solo
debe de fijarse a la base de uno de los
cuatro nucleotidos usados como
precursores en la sintesis de DNA)
 Los nucleotidos se marcan radiactivamente
con 32P y el 35 S.
 Tambien se pueden marcar los nucleotidos
con biotina o dixogigenina
marcaje de oligonucleotidos de DNA, para ser
Usados en la macarcion de sondas por la
la tecnología de PCR.
oligonucleotidos degenerados.
MARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOS
EN EL EXTREMO 3’
 SE MARCAN USANDO LA ENZIMA
TERMINAL DEOXINUCLEOTIDO
TRANSFERASA (TdT) QUE AGREGA
ISOTOPOS RADIACTIVOS DE P-32 EN
EL EXTREMO 3’
Marcación de oligonucleotidos
con TdT
MARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOS
EN EL EXTREMO 5’
• SE MARCAN USANDO LA ENZIMA
POLINUCLEOTIDO CINASA QUE
AGREGA UN SOLO FOSTATO DE P-32
EN EL EXTREMO 5’ DE CADA CADENA
DE DNA
RNAm
RT-PCR
Plantilla para PCR
cDNA
oligonucleotidos
Degenarados marcados
PCR
Sondas DNA marcadas.
SONDAS MOLECULARES
CONVENCIONALES.
DNA.
SONDAS.
RNA.
Sondas convencionales, DNA
obtenido por clonacion celular.
•EXTRACCION DEL DNA
PLASMIDICO
•RESTRICCION DEL
INSERTO
•DESNATURALIZACION
DEL DNA
Sondas convencionales, RNA obtenido
por clonación celular.
Método
Directo.
El marcador se detecta
unido a la sonda.
Método
Indirecto.
El marcador para poderse
Detectar debe unirsele una
Proteina detectora.
Marcaje
de
sondas
MARCAJE DE SONDAS,
METODO INDIRECTO
Generalidades de diferentes tipos de
marcaje.
 NICK – TRANSLATION.
 RANDOM PRIMER EXTENSION.
 MARCAJE TERMINAL POR RELLENO.
 MARCAJE DE OLIGONUCLEOTIDOS, descrito
en marcaje de fragmentos de DNA utilizando
PCR, se usa un nucleotido marcado con α–
32P–d NTP, α-35S–d NTP.
Marcación de SONDAS
NICK trasnlation.
 ACTUAN DOS ENZIMAS: DNasa 1 Y
DNApolimerasa 1
 SE UTILIZA ADN DOBLE CADENA
 SE INTRODUCE LA MELLA AL AZAR MEDIANTE
LAS DNAasas.
 PUEDEN HACERSE SONDAS NO RADIACTIVAS
NICK TRANSLATION.
Marcación de SONDAS
RANDOM PRIMER
 SE UTILIZA UNA SECUENCIA DE
OLIGONUCLEOTIDOS CONOCIDA.
 SE USA ADN SIMPLE CADENA (SE DESNATURALIZA
POR CALOR).
 SE USA EL FRAGMENTO DE KLENOW PARA
GENERAR UNA CADENA COMPLEMENTARIA
Metodo de cebador al azar
Marcaje terminal por relleno
Bibliografia.
 Biologia celular y molecular. Lodish, Berk,
Zipursky, 4ta. Edicion, editorial
panamericana.
 Biología molecular e Ingeniería Genética.
Luque, José Ángel. ; Editorial Harcourt.
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