DETECCIÓN DE VARIACIÓN EN EL NÚMERO DE COPIAS EN EL LOCUS
DE LA CADENA PESADA DE LA INMUNOGLOBULINA G MEDIANTE LA
TÉCNICA DE MLPA
Mercedes Delgado García1, Rufino Mondéjar García1, Francisca Solano Manchego2, Fuencisla
3
4
2,5
Matesanz del Barrio , Guillermo Izquierdo Ayuso y Miguel Lucas Lucas
1 Unidad de Esclerosis Múltiple, Hospital Universitario Virgen Macarena, Sevilla, España
2 Servicio de Biología Molecular, Hospital Universitario Virgen Macarena, Sevilla, España
3 Departamento de Biología Celular e Inmunología, Instituto de Parasitología y Biomedicina López Neyra, CSIC, Granada, España
4 Servicio de Neurología, Hospital Universitario Virgen Macarena, Sevilla, España
5 Facultad de medicina de Sevilla, España
Palabras clave: MLPA, IgGHC, sonda
Introducción y Objetivos: El locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina G (IgGHC) está localizado en el cromosoma 14q32.33. En esta región
se encuentran 4 genes: IGHG1, IGHG2, IGHG3 e IGHG4, que codifican para la región constante de las subclases de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4,
respectivamente). Existen SNPs localizados en esta región que se asocian al índice de IgG en pacientes con Esclerosis Múltiple (MS). Estos SNPs no
se encuentran en equilibrio Hardy Weinberg (datos tomados de 1000 Genome Project data en población caucásica). Además, estudiando el locus, se
observa que es una región en la que hay descritas una gran cantidad de variaciones en el número de copias.
Nuestro objetivo fue diseñar unas sondas específicas de la región de este locus para poder
detectar variaciones en el número de copias mediante la técnica MLPA® (Multiplex Ligationdependent Probe Amplification) (MRC-Holland). Esta técnica permite amplificar multitud de genes
en una única reacción de PCR. Existen kits comerciales diseñados para su uso en investigación y en
diagnóstico de enfermedades genéticas, porque detectan variaciones en el número de copias,
determinan el estado de metilación, detectan mutaciones puntuales conocidas y cuantifican
expresión génica.
Para los genes no incluidos en los kits comercializados (como era nuestro caso), hay que hacer un
diseño de sondas específicas y se pone a punto la técnica añadiendo una serie de sondas de
referencia.
Material y Métodos: Previo a la puesta a punto de la técnica, las sondas deseadas son diseñadas
Figura 1: Resumen gráfico del fundamento de la técnica de MLPA:
las secuencias de hibridación derechas e izquierda se unen a la
secuencia complementaria de ADN. Ambas sondas se unirán por
una ADN-ligasa y se amplificarán en una PCR múltiple con unos
cebadores universales. Los resultados se visualizan en forma de
picos mediante electroforesis capilar. (MRC-Holland)
siguiendo las instrucciones de MRC-Holland. Una vez listas, se añaden al DNA total para que
hibriden con los fragmentos génicos para los cuales están diseñadas. Una vez las sondas están
ligadas, los fragmentos de doble cadena son amplificados por una PCR convencional (gracias a que
todas las sondas tienen extremos comunes que hibridan con un único par de cebadores). Los
resultados se visualizan mediante electroforesis capilar, en un secuenciador ABI 3130 Genetic
Analyzer (Figura 1). En la representación gráfica, en forma de picos de expresión, correspondientes
a los diferentes fragmentos, con una determinada altura y área, podemos detectar de visu y
cuantificar mediante el software Coffalyser si existen delecciones exónicas o duplicaciones.
Resultados: Fueron diseñadas con éxito e introducidas
en un kit de sondas de referencia tres sondas de
diferentes regiones del locus IgGHC, adyacentes a tres
SNPs asociados al índice de IgG en MS. Paralelamente
también se realizó el estudio en líneas celulares
linfoblastoides (LCL). Fueron detectadas variaciones en
el número de copias en el locus IgGHC tanto en ADN de
pacientes de EM como en ADN de LCL .Los resultados
fueron reproducibles. (Figura 2)
Conclusión: La introducción de sondas diseñadas
específicas de fragmentos génicos no recogidos en los
kit comerciales de MLPA® es de gran utilidad en
investigación, debido a que podemos detectar variación
en el número de copias de varios genes, con un proceso
relativamente sencillo.
Figura 2: Representación de resultados del método MLPA. De cada apartado (a, b c y d), el electroferograma superior corresponde a
una muestra control. La numeración de las sondas creadas se muestra en el gráfico superior del apartado a, siendo la misma en todos
los electroferogramas. a) Delección de un alelo en las sondas 2 y 3 en LCL. b) Delección completa en las sondas 2 y 3 en LCL. c)
Duplicación de un alelo en la sonda 2 en un paciente de EM. d) Delección de un alelo en la sonda 1 en un paciente de EM.
XXI REUNIÓN DE LA SOCIEDAD ANDALUZA DE ANÁLISIS CLÍNICOS. 6, 7 Y 8 DE MARZO DE 2014
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