Diagnóstico molecular en infecciones oculares
Dr. Carlos Álvarez-Guzmán. Dr. Alejandro Rodríguez-García. Dr. Jaime Torres-Gómez.
Instituto de Oftalmología y Ciencias Visuales, Tec Salud.
Cátedra de Investigación en Oftalmología y Ciencias Visuales
Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud del Tecnológico de Monterrey
Introducción
‣ Reacción en Cadena: productos de reacciones son sustratos de la segunda y sucesivamente
PCR
‣ de la Polimerasa: única enzima usada en la reacción
Van Gelder, R. Applications of the polymerase
chain reaction to diagnosis of ophthalmic
disease. Surv Ophthalmol 46:248-258, 2001.
Principios de PCR
PCR eficiencia
El grado de amplificación logrado y la sensibilidad son altas
35 ciclos
PCR diagnóstico
>1010 amplificación
una sola molécula
de DNA
34 billones de copias
en pocas horas
✓ fragmento de 500 pares de bases correspondería a 20 ng de DNA
✓suficiente para observar en gel de agarosa de electroforesis teñido con bromuro de etidio
PCR proceso
acuoso
Fuente de DNA
vítreo
sangre
Muestra de DNA
Secuencia a amplificar
gen (mDNA)
neuropatía óptica de Leber
gen UL97
citomegalovirus (CMV)
gel electroforesis :acrilamida o agarosa
primers
DNA polimerasa
termoestable
bases nucleotídicas
buffers
Mg++
papel de nitrocelulosa
Obtención de muestras
Cualquier especimen ocular o biopsia
Raspado conjuntival
colocarlo en solución
salina balanceada
Paracentesis CA
Punción vítrea
50 microlitros
100-150 microlitros
ESTERILIDAD
algunas veces de
cassette de infusión
✓congelarlos en hielo seco o nitrógeno líquido (-80°C)
✓evitar congelar y descongelar: degradación DNA
✓En ausencia de condiciones: sólo colocar la muestra en tubo de microfuga
Eficacia del PCR
✓Capacidad de realizar la prueba en cantidades pequeñas de tejido.
✓Sensibilidad alta 10-100 genomas (copias DNA) que corresponde a menos de una UFC
Puntos a considerar
Sensibilidad
CONTAMINACIÓN
✴pequeñas cantidades de
microorganismos
✴pipetas, personal de
laboratorio
✴falsos positivos
✴DNA latente en huésped
✴herpes: EBV, CMV
✴Mantener el contexto
clínico
Especificidad
✴El DNA del huésped y el primer deben
empatar perfectamente para obtener un
producto.
✴POLIMORFISMOS entre cepas del
mismo organismo
✴Falsos negativos
✴AD19 CMV
PCR en uveítis posterior
Knox et al. Uveítis virales
-PCR en acuoso o vítreo
-37 ojos de dilemas en uveítis
-opacidad de medios o historia natural
inconsistente con curso clínico
-diagnóstico de uveítis viral en 25 pacientes.
-casos negativos: toxoplasmosis
Indicaciones
-opacidad de medios: catarata o vitritis.
-Mitchell et al
-primers VVZ, CMV
-9 pacientes: 4 positivos CMV y 3 VVZ.
-el resto toxoplasmosis
Knox CM, Chandler D, Short GA, Margolis TP: Polymerase chain
reaction-based assays of vitreous samples for the diagnosis of
viral retinitis. Use in diagnostic dilemmas. Ophthalmology
105:37–44,
Toxoplasmosis
✓Utilidad de PCR:
✓casos atípicos
✓Primoinfección: parecida a oros tipos de retinitis
✓estudios iniciales poca sensibilidad <50%, la cual aumentó con el uso de secuencias altamente
repetidas
✓ Montoya el al.
✓DNA en 80% de casos de toxoplasmosis ocular con IgG positivas
✓ Bou et al DNA Toxoplasma gondii en
✓ sangre periférica en pacientes con toxoplasmosis ocular activa, reactivaciones
diagnosticadas por este método
PCR + en uveítis posterior infecciosa
Harper T, Miller D, Schiffman J, Davis J. Polymerase
chain reaction analysis of aqueous and vitreous
specimens in the diagnosis of posterior segment
infectious uveitis. Am J Ophthalmol 2009;147:140-147.
133 px
corioretinitis
infecciosa
433 PCR
105 acuoso y 38 vítreas
HSV, VVZ, CMV
alteración en tratamiento
resolución en 25 pacientes
¿Acuoso o vítreo?
Harper T, Miller D, Schiffman J, Davis J. Polymerase chain reaction analysis of aqueous and vitreous specimens in the diagnosis of
posterior segment infectious uveitis. Am J Ophthalmol 2009;147:140-147.
PCR en edoftalmitis
Cultivo
✴resultados lentos
✴inicio de tratamiento empírico
El EVS reportó eficiencias
del 70% en el cultivo. 1
PCR
✴secuencias DNA ribosomal: diseño primers
(difícil).
✴fluidos o biopsias de ojos con endofltalmitis
✴utilidad para cultivos negativos 2.
✴bacterias en:
✴100% cultivo positivo
✴44% cultivo negativo
✴1/3 de la negativas: hongos
✴primers para hongos 3.
90% de las endoftalmitis pueden ser detectadas por PCR
1. Microbiologic factors and visual outcome in the en- dophthalmitis vitrectomy study. Am J Ophthalmol 122:830– 46, 1996
2. Therese KL, Anand AR, Madhavan HN: Polymerase chain reaction in the diagnosis of bacterial endophthalmitis. Br J Ophthalmol 82:1078–82, 1998
3. Hidalgo JA, Alangaden GJ, Eliott D: Fungal endophthalmitis diagnosis by detection of Candida albicans DNA in intraocu- lar fluid by use of a species-specific polymerase
chain reac- tion assay. J Infect Dis 181:1198–201, 2000
PCR en edoftalmitis temprana
‣Estudio prospectivo de 64 ojos
‣Signos de endoftalmitis hasta 1 año después de catarata
‣Muestras de vítreo por punción o vitrectomía
‣cultivo y PCR (resultado principal)
‣Controles de vitrectomías de casos no inflamatorios
Resultados
‣DNA bacteriano en 37 pacientes (66%) comparado con 19
(34%) cultivo
‣Sólo un paciente cultivo + (Nocardia) PCR ‣18 muestras + para cultivo y PCR 100% de concordancia en
patógeno.
Cornelia RJ, et al. Anm J Ophthalmol 2012;153: 1031-1037
PCR en edoftalmitis tardía
‣Complicación
tardía, amenaza visión y representa retos
diagnósticos.
‣P acnes, S. epidermidis, Actinomyces israelli
‣Hongos
‣Microorganismos difíciles de cultivar
‣detección por cultivo solo en 50%
‣Diagnosticados por clínica
‣Tratamiento:
vitrectomía, capsulectomía
reemplazo de lente
‣Terapia médica puede ser efectiva. S. epidermidis
y
Lohmann et al.1
-primers de DNA 16 S ribosomal
-25 ojos con endoftalmitis tardías
-cultivo acuoso y microscopía 0% detección
-cultivo vítreo 24% detección
-PCR acuoso 84% detección
-PCR y punción vítrea diagnóstico en 92% de los
casos
Lohmann CP, Linde HJ, Reischl U: Improved detection of microorganisms by
polymerase chain reaction in delayed en- dophthalmitis after cataract surgery.
Ophthalmology 107: 1047–51; discussion 1051–2, 2000
PCR en enfermedades externas
‣Casos
de conjuntivitis y queratitis: cultivo y tinción de
Gram
‣Adenovirales el ELISA no permite identificar serotipos
‣Takeuchi et al. nuevo serotipo asociado a una epidemia
en Japón 1.
‣Herpes y conjuntivitis de inclusión Chlamydia
‣Jackson et al. PCR multiplex 2
‣adenovirus y HSV: frotis conjuntival
‣una sola reacción se detectan múltiples patógenos
1. Takeuchi S, Itoh N, Uchio E: Adenovirus strains of
subgenus
D associated with nosocomial infection as new
etiological agents of epidemic keratoconjunctivitis in
Japan. J Clin Mi- crobiol 37:3392–4, 1999
‣Acanthamoeba
‣retraso en el diagnóstico consecuencias
devastadoras
‣difícil cultivo y tinción con blanco de calcofluor baja
sensibilidad
‣Lehman PCR de raspado epitelial
‣84% de sensibilidad comparada con 53% de cultivo
‣lágrima tiene 66% sensibilidad
‣Marthers et al
‣DNA en 24 de 33 raspados epiteliales
‣distintas a A. castellanii
2. Jackson R, Morris DJ, Cooper RJ: Multiplex
polymerase chain reaction for adenovirus and
herpes simplex virus in eye swabs. J Virol
Methods 56:41–8, 1996
3. Mathers WD, Nelson SE, Lane JL:
Confirmation of confocal mi- croscopy
diagnosis of Acanthamoeba keratitis using
polymerase chain reaction analysis. Arch
Ophthalmol 118:178–83, 2000
Uso exclusivo de PCR en oftalmología
Microorganismos de difícil cultivo
Serologías de difícil acceso
Resistencia a antimicrobianos
Toxoplasma gondii
‣tradicionalmente tratado como única cepa
‣ Boothroyd 1
‣ 3 cepas molecularmente identificables
‣ sensibilidades a sulfas: heterogenicidad en
respuesta a tratamiento
Citomegalovirus
‣identificar cepas resistentes es crucial
‣evitar implante de ganciclovir
‣mutaciones en gel UL97
‣Liu et al.2 mutaciones puntuales que confieren
resistencia en 11 muestras de vítreo
Síndromes mascarada
‣ linfoma de células B
‣ imitar un proceso uveítico
‣ oncogenes en control de inmunoglobulinas
1. Sibley LD, Boothroyd JC: Construction of a molecular
karyotype for Toxoplasma gondii. Mol Biochem Parasitol
51:291–
300, 1992
2. Liu W, Kuppermann BD, Martin DF: Mutations in the
cy- tomegalovirus UL97 gene associated with
ganciclovir-resis- tant retinitis. J Infect Dis 177:1176–81,
1998
Conclusiones
• El PCR es una técnica de biología molecular disponible en nuestro medio.
• El conocimiento de las bases moleculares y el procesamiento de la muestra es
indispensable para una alta sensibilidad de la prueba.
• Diseñar estrategias diagnósticas: uso de cultivos, tinciones y pruebas de DNA es
más útil que la sensibilidad de pruebas separadas.
• Tomar en cuenta el contexto clínico para la interpretación de los resultados
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