Proteoglicanos heparan sulfato como reguladores de la señal del FGF2 en células
endoteliales cerebrales.
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El FGF2 es un potente estimulante de la angiogénesis en procesos de cicatrización de heridas y
crecimiento tumoral, ya que induce la degradación de la ME, migración y proliferación de células
endoteliales y diferenciación a tubos vasculares.
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In vivo los HS se encuentran unidos covalentemente a proteínas, formando HSPG.
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Existen dos tipos, de membrana (syndecan y glypican) y secretados (perlecan).
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Las células tienen la habilidad de ajustar las cadenas de HS respondiendo a cambios
ambientales.
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Alteraciones en HSPG fueron reportadas durante el proceso de malignización.
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La unión del FGF2 al receptor tyrosin kinase (FGFR) requiere la presencia de HSPG.
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El objetivo de este trabajo es examinar la contribución de los HSPGs de diferentes células
cerebrales endoteliales en la señalización y angiogénesis del glioma.
Glioma:Tumor cerebral formado por el crecimiento de células anormales o proliferación
incontrolada de células en el cerebro. Los tumores cerebrales primarios involucran a
cualquier masa que se origina en el cerebro y no que se disemine hasta el cerebro
desde otra parte del cuerpo.
Requerimiento de HS en la señalización del FGF2 en células endoteliales
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Incubación con NaCl para
inhibir la sulfatación de los HS.
Heparina y SO4 son sustitutos
del HS.
BrdUrd es requerido para la
proliferación celular
(mitogénesis).
uPA es una serina proteasa
que rompe coágulos de la ME
facilitando la migración celular
durante la angiogénesis.
Caracterización de HSPGs de células endoteliales como co-receptores
del FGF2.
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HSPGs fueron extraídos de diferentes tipos
de CE y fueron tratadas con heparintinasa y
condroitinasa para degradar secuencias de
GAG.
Corridas en SDS-page.
MBE: 5, 7-9.
HMVEC: 6
HSPGs más abundantes:
Syndecan-2 (MBE, HMVEC)
Syndecan-4 (HUVEC, HSVEC)
Menor cantidad:
Syndecan-1
Syndecan-3
Sólo detectable en HMVEC:
Glypican-1
Presente en todos los tipos celulares:
Perlecan
Caracterización de HSPGs de células endoteliales como co-receptores
del FGF2.
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HSPGs de MBE fueron
fraccionados según la
habilidad para unirse al
FGF2, al pasar por una
columna.
El complejo (C) y el
sobrenadante (S) fueron
corridos en SDS-page.
Calles:
1- control
3- HSPGs unidos al
FGF2.
4 y 5- sitios de unión al
FGF2 bloqueados.
6 y 7- con heparina
(sustituto de HS)
Caracterización de HSPGs de células endoteliales como co-receptores
del FGF2.
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Se aislaron HSPGs de MBE y se
incubaron con el FGFR1c
inmovilizado, en presencia o ausencia
de FGF2.
Se corrió en SDS-page.
Calles:
1-control
2- control negativo con heparitinasa.
3- control negativo sin FGF2.
4- idem control (sugiriendo que todas
las proteínas presentan secuencias
HS con similar potencial para
promover la unión del FGF2 al
FGFR1c)
Los complejos son resistentes a una
concentración 0.6 M de NaCl pero se
disocian a mayores concentraciones.
Actividad de HSPGs de diferentes células endoteliales cerebrales como
promotores de la señalización del FGF2
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Células FR1c-11 con HSPGs endógeno bloqueado fueron tratadas con y sin FGF2 y
con diferentes concentraciones de HSPG exógeno. Luego fueron corridas en
Western blot.
Observándose que los HSPG asociados a membrana y los extracelulares
promueven la unión del FGF2 al FGFR1c de igual modo.
Reconstrucción del complejo FGF2-HSPG-FGFR1 in situ.
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Secciones congeladas de tejidos de
glioma fueron primero incubadas con
FGF2 y luego lavadas con proteína de
fusión soluble FR1-AP.
Rojo: complejo ternario.
Verde: células endoteliales.
Azul: núcleos.
A y E: GBM (incremento de la unión al
receptor).
B y F: control negativo (heparitinasa)
C y G: control negativo (sin FGF2)
D y H: control (células normales)
El incremento de la unión se debe al
aumento en la cantidad de HSPG, y
no a la alteración de la estructura del
HS.
Detección Inmunohistoquímica de las proteínas del core de HSPGs en
secciones de parafina.
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Tratadas con heparitinasas: A y B.
Bajo nivel de Syndecan-4 en células normales y del glioma (C y D).
Glypican-1 es sobreexpresado en células endoteliales de vasos de gliomas (F) y
bloqueado en normales (E).
Marker de CD31 en vaso de glioma (G).
Syndecan-1 es indetectable en células normales y del glioma (H: control positivo).
Detección de las proteínas del core en glioma humano y en células
normales de cerebro por inmunofluorescencia.
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Syndecan-2 es incrementado
medianamente en células del glioma,
en la periferia del tumor.
Syndecan-3 es expresado
moderadamente en ambos.
Glypican-1 es abundante en células
tumorales mientras que en células
normales está bloqueado.
Entonces, el Glypican-1 es el
responsable de los elevados niveles
de HSPG total en las células del
glioma.
HSPGs fueron extraídos de células MBE tranfectadas con Glypican-1/ Syndecan-1 cDNA y células
Mock. Luego corridos en SDS-page.
La sobreexpresión del Glypican-1 estimula el crecimiento de las células endoteliales y estimula la
mitogénesis inducida por FGF2, la cual es independiente de la composición de la cadena de HS.
Conclusión :
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Todas las proteínas core de HSPGs de células endoteliales, presentan cadenas HS capaces de
unirse al FGF2 estabilizando el complejo con el FGFR1c y activando a este receptor tyrosine
kinase.
Glypican-1, el cual es sobreexpresado en vasos del glioma, tiene la habilidad específica para
sensibilizar la mitogénesis inducida por el FGF2 en células endoteliales de cerebro.
VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) y FGF2 pueden actuar sinérgicamente o tener
distintos roles en el desarrollo tumoral por mostrar su actividad angiogénica en diferentes
estadíos y en diferentes regiones del tumor.
La expresión de FGF2 predomina en tumores pequeños o en la periferia tumoral, mientras, el
VEGF lo hace en grandes tumores y en el centro.
La maquinaria enzimática en el Golgi, responsable de la síntesis y modificación de HS no
distingue entre diferentes proteínas core. Esto no implica que la composición de las cadenas de
HS sea estática. La actividad de unión del HS cambia durante el desarrollo tumoral y la
malignización.
La sobreexpresión de Glypican-1 en células endoteliales estimula el crecimiento e induce la
respuesta del FGF2, a pesar de no aumentar la cantidad total de HSPGs.
Los sitios de unión de las cadenas HS de Glypican están localizados cerca de la membrana
celular, mientras que los de Syndecan están cerca del extremo N- terminal del ectodominio
variable.
La proximidad de las cadenas de HS a la superficie celular hace de soporte en la formación del
complejo ternario.
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Glypicans se distinguen de Syndecans porque su ancla a membrana es vía
glicosilfosfatidilinositol.
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Glypican-1 puede suplir al FGF2 en células endoteliales de cerebro y/o la composición
de HSPGs durante la angiogénesis.
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Glypican-1puede actuar como chaperona protegiendo al VEGF del daño oxidativo.
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Glypican-1 actúa como co-receptor de baja afinidad para el potente inhibidor de la
angiogénesis.
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Glypican-1 sensibiliza a las células endoteliales para que el FGF2 active la
angiogénesis característica de gliomas de alto grado.
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Como el FGF2 es resistente a la radiación, la potenciación de esta señal de
supervivencia dada por el Glypican-1 puede ser responsable de la resistencia a la
radiación del glioma.
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El rol central de Glypican-1 en la señalización del FGF2 y del VEGF puede presentarse
como una atractiva oportunidad para la intervención terapéutica.
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