ESTUDIO DE SENSIBILIDAD A LOS AGENTES
ANTIMICROBIANOS
Raúl Gil Orts
MIR 2 Análisis Clínicos
INTRODUCCIÓN
El estudio de la sensibilidad a los agentes antimicrobianos :
- se lleva a cabo mediante antibiogramas
- su objetivo es evaluar la susceptibilidad in vitro
- el resultado servirá como factor predictivo de la eficacia clínica del agente
antimicrobiano
Una vez conocida la sensibilidad del microorganismo:
- se reduce la morbi-mortalidad
- se reduce la duración de la estancia hospitalaria
- contribuye a una mejor evolución del paciente
- reduce los costes sanitarios
Es una herramienta básica para evitar el mal uso de los antimicrobianos
INTRODUCCIÓN
El estudio de sensibilidad pueden realizarse por distintos métodos que requieren:
- Aislamiento absoluto de la cepa que se va a testar
- Identificación adecuada de la cepa para:
- tipo de antibiograma
- interpretación de los resultados
- Medios y consumibles adecuados
Métodos:
- Difusión
- Antibiograma disco-placa
- Método de tiras Epsilon (Etest)
- Dilución
- Dilución en agar
- Dilución en caldo
- Macrodilución
- Microdilución
Métodos de difusión
-Fundamento:
-Difusión del antibiótico desde un soporte sólido hacia una base de agar
Agar M-H
Antibiótico
-La base de agar es generalmente Mueller-Hinton recomendado por CLSI por:
-Buena reproducibilidad
-Baja concentración de inhibidores que permite el crecimiento de la mayor
parte de las bacterias patógenas
-Se le añaden los suplementos necesarios para asegurar el crecimiento de
organismos exigentes
Métodos de difusión
Antibiograma disco-placa
- Es uno de los recomendados por el CLSI para la determinación de la sensibilidad
bacteriana a los antimicrobianos
-Ampliamente utilizado en la práctica habitual de los laboratorios
-Fundamento:
-Se deposita en la superficie de agar de una placa de petri previamente inoculada
con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes
antibióticos.
-El antibiótico difunde radialmente a través del espesor del agar a partir del disco
formándose un gradiente de concentración.
- Transcurridas 18-24 horas de incubación, se estudia el crecimiento en ellas. Se
valora el diámetro de la zona de inhibición que se forma alrededor de cada disco y
se compara con las referencias informando si el microorganismo es Sensible,
Intermedio o Resistente.
Métodos de difusión
Antibiograma disco-placa
Interpretación:
-Está basada en la correlación existente entre el diámetro de los halos de inhibición y
la respuesta in vivo.
-Esta correlación está estudiada para los antibióticos más comunes y los principales
agentes bacterianos y puede ser consultada en diferentes institutos y sociedades
( MENSURA, EUCAST, CLSI)
-Inconveniente: ofrece resultados cualitativos ( S, I, R )
No da información sobre CMI
Procedimiento
Antibiograma difusión
Disco-placa
Inoculación
Placa agar Mueller-Hinton
Dispensador de discos ATB
Métodos de difusión
Método de tiras Epsilon (Etest)
Comparte el fundamento con el anterior pero aquí se puede conocer la CMI
Es un método alternativo para el estudio cuantitativo de la sensibilidad antimicrobiana,
sencillo y se correlaciona bien con el método de dilución en caldo
Consiste en una tira de plástico no poroso que incorpora un gradiente predefinido de
antimicrobiano .
Se inocula la placa de agar con el microorganismo, se coloca la tira de E-test sobre su
superficie produciéndose la difusión del antibiótico desde el soporte hasta el agar.
Tras la incubación se puede observar una zona de inhibición elipsoidal y simétrica. La
CMI será el valor obtenido en el punto de intersección de la elipse de inhibición con la
tira.
Tiras Epsilon (E-test)
Lectura de resultados:
Después del período de incubación se lee la CMI en el punto de intersección
entre el extremo de inhibición de la elipse y la tira de E-test.
-Consideraciones:
Cuando la CMI coincide entre dos marcas se informa el valor superior
Si se observan intersecciones diferentes, se informa el valor más alto,
siempre que la diferencia entre los dos valores no sea superior a la mitad de un paso
de dilución doble.
Si se observan colonias grandes en la zona de inhibición puede representar
cultivo mixto o variantes resistentes. Debemos repetir el test a partir del cultivo
primario. Si se repite el mismo patrón tendremos que trabajar las colonias que
aparecen en la zona de inhibición.
Métodos de dilución
-Fundamento:
Estos métodos se basan en la determinación del crecimiento del
microorganismo en presencia de concentraciones crecientes del antimicrobiano que se
encuentra diluido en el medio de cultivo (caldo o agar).
Después de la incubación adecuada se observa la turbidez de los tubos, que
indica desarrollo bacteriano. El microorganismo crecerá en los tubos que no
contengan suficiente agente antimicrobiano como para inhibir su desarrollo.
La concentración de antibiótico que presente ausencia de crecimiento se
designa como la Concentración Mínima Inhibitoria.
-Indicaciones:
Se consideran de referencia para determinar de forma cuantitativa la
actividad de los antimicrobianos. ( uso en centros de referencia)
En estudios de correlación para evaluar otros métodos
Estandarizan el estudio de susceptibilidad y son la base de estudios
epidemiológicos y poblacionales
-Ventajas: aportan resultados de CMI y CMB (concentración mínima bactericida)
-Inconvenientes: Son más complejos técnicamente y más caros que los de difusión
Exigen una absoluta estandarización debido a la gran cantidad de
variables de los que depende su realización
Alto grado de laboriosidad (no posible en laboratorios alta carga)
Dilución en agar
Es un método bien establecido para la determinación de la sensibilidad a los
antimicrobianos.
Se preparan varias placas de medio de cultivo sólido en base agar MuellerHinton cada una con una determinada concentración de antimicrobiano y se hace
crecer el microorganismo.
Tiene buena reproducibilidad de los resultados de sensibilidad
Permite buen crecimiento de la mayoría de patógenos.
Dilución en agar
-Interpretación:
1. La CMI será la concentración de antibiótico contenida en el agar de la primera
placa sin colonias bacterianas.
2. Si el microorganismo crece en todas las placas, la CMI es superior a la mayor
concentración de antimicrobiano estudiada.
3. Si no crece en ninguna de las placas, la CMI es inferior a la menor
concentración de antimicrobiana estudiada.
Dilución en caldo
El crecimiento se realiza en un medio líquido, en el que se ha realizado una dilución
conocida del antimicrobiano.
En función del volumen de medio utilizado tenemos dos tipos:
Macrodilución: el volumen es superior o igual a 1 mL
Microdilución: se suelen emplear volúmenes de 0,1 mL
-Macrodilución:
Bien estandarizado
Debido a la laboriosidad del procedimiento y la disponibilidad de otros
sistemas de dilución no suele emplearse de rutina.
Macrodilución
Inoculación
0,5mL de
inóculo
Incubación a temperatura y
atmósfera óptima 18-24 h
Interpretación
Interpretación del estudio:
La CMI será la concentración de antibiótico contenida en el tubo de ensayo
del primer tubo sin presencia de turbidez.
Si el microorganismo crece en todos los tubos, la CMI es superior a la mayor
concentración de antimicrobiano estudiada.
Si no crece en ningún tubo, la CMI es inferior a la menor concentración de
antimicrobiano estudiada.
Dilución en caldo
Microdilución en caldo:
Es el método de referencia dentro de los métodos
de dilución para estudiar la sensibilidad a
antimicrobianos y sirve como base para la
realización de métodos automáticos y
semiautomáticos.
Está basado en la inhibición del crecimiento
microbiano en un medio líquido en presencia de
una concentración de antibiótico en progresión
aritmética.
Interpretación:
-La CMI será la concentración de antibiótico contenida en el primer pocillo donde no se
observa crecimiento bacteriano (no turbidez)
-Si el microorganismo crece en todos los pocillos, la CMI es superior a la mayor
concentración de antimicrobiano estudiada. Si no crece en ningún pocillo, la CMI es
inferior a la menor concentración de antimicrobiano estudiada.
Dilución en caldo
Sistema automatizado de microdilución en caldo:
Se automatiza del proceso de inoculación a la lectura del resultado del método de
microdilución.
Ideales para grandes volúmenes de trabajo.
Ventajas: manejo sencillo, menor consumo de recursos humanos, alta
reproducibilidad, análisis de resultados mediante sistemas expertos y su rapidez.
Inconvenientes: elevado coste en consumibles, sólo garantía para investigar
microorganismos de crecimiento rápido y sin requerimientos especiales.
Interpretación: 1. Se emplea un análisis de regresión para determinar la CMI derivada
del crecimiento observado.
Interpretación de los métodos de estudio de
sensibilidad a los agentes antimicrobianos
En los métodos descritos se obtiene un valor numérico, en forma de mm o de CMI
o CMB. Representan concentraciones que se deberían alcanzar en el lugar de
infección
Esta traslación no se puede realizar o es muy compleja, con lo que se categoriza
dichos valores numéricos en forma de interpretaciones cualitativas que informen
de la susceptibilidad de cada uno de los antimicrobianos frente a un determinado
germen.
Las categorías interpretativas son:
- Sensible (S): el microorganismo está inhibido a la concentración de
antimicrobiano que suele alcanzarse cuando se prescribe la dosis recomendada
para el lugar de la infección. Hay una alta probabilidad de que el paciente responda
al tratamiento.
- Intermedio (I): la tasa de respuesta puede ser más baja que para los
microorganismos sensibles. Implica eficacia clínica en las localizaciones corporales
donde los antimicrobianos están fisiológicamente concentrados o cuando una
dosis superior a la habitual puede ser empleada.
- Resistente (R): el crecimiento del microorganismo no está inhibido por la
concentración de antimicrobiano alcanzable con la dosis habitual. El agente no es
eficaz en el tratamiento contra el microorganismo.
CONTROL DE CALIDAD
Necesidad de control:
Debido al gran número de factores que pueden afectar el resultado
Para armonizar y estandarizar los procedimientos realizados y los resultados obtenidos
Controles de calidad a varios niveles:
- Controles de contaminación: aseguran que el microbiano obtenido pertenece al
germen en estudio y no a un contaminante.
Se incuba un medio de cultivo de los utilizados sin inocular – debe ser estéril
- Controles de crecimiento: controlan que los medios de cultivo utilizados soportan
adecuadamente el crecimiento de los gérmenes a evaluar.
Se lleva a cabo mediante inoculación del microorganismo en medio de
cultivo que se incubará a igual temperatura y duración que el resto del ensayo. El
control presentará crecimiento homogéneo y abundante.
- Controles de resultado: aseguran que los resultados obtenidos no son diferentes a
los reales.
Se usan cepas de referencia con CMI, CMB o diámetros conocidos. Los
resultados de dichas cepas deben estar dentro del rango de resultado permitido.
GRACIAS
Gracias
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Pruebas microbiológicas de sensibilidad antimicrobiana