ELECTROFUSION DE CÉLULAS DENDRÍTICAS
SINGÉNICAS Y CÉLULAS TUMORALES PARA LA
GENERACIÓN DE UNA POTENTE VACUNA
TERAPEÚTICA FRENTE AL CANCER
Jorgen Kjaergaard et al.
Cellular Inmunology 225 (2003) 65-74
MARIA JOSÉ MARTÍNEZ ORTIZ
R1 ONCOLOGÍA MÉDICA
HGU DE ELCHE
INTRODUCCIÓN
Células dendríticas: las más potentes y eficaces células
presentadoras de Ag del organismo.
Interdigitadas: Distribuídas en la mayoría de los órganos
Muy abundantes en zonas LT de GL y bazo.
En epidermis, formas inmaduras: células de Langerhans
Muy eficientes en la presentación de Ag proteicos al LT.
Foliculares: atrapan Ag unidos a Ac o a productos del complemento
y los expresan en su superficie para que sean reconocidos por los
LB.
INTRODUCCIÓN
Inmunidad frente a tumores
CPA procesan y presentan los péptidos tumorales en su
superficie como péptidos unidos a receptores MHC tipo II
Las células tumorales en sus receptores MHC tipo I
presentan Ag peptídicos específicos del tumor
Inmunidad frente a tumores de 2 tipos: celular y humoral.
Humoral: CMCDA, CDC y opsonización
Celular: LT CD8 citolíticos, células NK y macrófagos.
INTRODUCCIÓN

CÉLULAS PRESENTADORAS DE Ag
INTRODUCCIÓN
Inmunidad frente a tumores
INMUNIDAD HUMORAL

INTRODUCCIÓN
Inmunidad frente a tumores
INMUNIDAD HUMORAL

INTRODUCCIÓN
Inmunidad frente a tumores
INMUNIDAD HUMORAL

INTRODUCCIÓN
Inmunidad frente a tumores
INMUNIDAD CELULAR

INTRODUCCIÓN
Inmunidad frente a tumores
INMUNIDAD CELULAR

INTRODUCCIÓN
Inmunoterapia tumoral
Control del crecimiento tumoral mediante la activación del
sistema inmune.
La activación de una respuesta antitumoral específica es
consecuencia de la expresión por las células cancerosas de
nuevos antígenos denominados tumor-específicos o tumor
asociados.
Inmunoterapia activa: estimulación de los componentes del
sistema inmunitario responsables de la respuesta
antitumoral.
Vacunas antitumorales
Inmunidad activa específica
INTRODUCCIÓN
Células singénicas
Diferentes células de la misma especie y genéticamente idénticas.
Células alogénicas
Diferentes células de la misma especie pero genéticamente no
idénticas.
Electrofusión
Procedimiento a mediante el cual se obtienen híbridos fusionando
células dendríticas y tumorales tras ser estas previamente
sometidas a procesos de purificación, suspensión en medio de
cultivo, centrifugación, electroforesis e incubación.
INTRODUCCIÓN

ELECTROFUSIÓN
A.CD: rojas; Céls. Melanoma: verdes; híbridos: amarillas
B.Híbrido celular: CD+ cél. melanoma
C.Microscopio: fluorescencia híbrido celular con doble núcleo
D.Fagocitosis de céls. melanoma por CD
INTRODUCCIÓN
Obtención de células dendríticas




Mediante leucaféresis se seleccionan monocitos de sangre
periférica que posteriormente se someten a un período de
cultivo in vitro con citoquinas consiguiendose células
dendríticas.
Se condiciona a estas con un estímulo de activación y
maduración mediado por citokinas.
Se carga en las CD el antígeno.
Son reinfundidas de forma I.V. o intradérmica al receptor.
INTRODUCCIÓN

OBTENCIÓN DE CÉLULAS DENDRÍTICAS
INTRODUCCIÓN

La principal dificultad para el uso clínico de
las CD radica en la obtención de cantidades
suficientes de células, debido a que en la
sangre representan sólo el 0,1% de los
leucocitos y a que en el estadio inmaduro
las células no poseen la capacidad de
multiplicarse.
INTRODUCCIÓN


Los principales inconvenientes que
presenta el control inmunológico del
cáncer es:
La dificultad para aislar antígenos
tumorales específicos
Escasa capacidad inmunógena de los
tumores humanos.
INTRODUCCIÓN

Conjugación con adyuvantes
Entre las estrategias desarrolladas para potenciar
y conseguir una respuesta inmune efectiva, se
encuentra el proceso de conjugación del antígeno
tumoral con adyuvantes ( adyuvante completo o
incompleto de Freund, aluminio, liposomas,..) de
alto poder inmunógeno.
Los adyuvantes no necesariamente necesitan
hallarse unidos físicamente al antígeno, es el caso
del levamisol, el IFN-gamma, el sagramostin o la
BCG.
INTRODUCCIÓN



INCONVENIENTES ESTUDIOS PREVIOS
El uso de células dendríticas como vehículo para la presentación de
Ag tumorales débiles es teoricamente atractiva en el diseño de una
vacuna terapeútica.
Estudios previos: trasfiriendo RNA y DNA derivado de tumores a
las CD, estimulando las CD con células tumorales necróticas o
apoptóticas, con células tumorales lisadas o con exosomas derivados
de tumores.
INTRODUCCIÓN



INCONVENIENTES ESTUDIOS PREVIOS
Variaciones en el progenitor seleccionado para obtener CD, en los
medios de cultivo utilizados y las diferencias significativas en
estadio madurativo y funciones de las subpoblaciones celulares
obtenidas, además de que los modelos tumorales presentan diversos
grados de inmunogenicidad y de capacidad de crecimiento.
El método tradicional de fusión utilizando PEG( polietilenglicol)
tiene eficacia variable, toxicidad y pobre reproductibilidad
OBJETIVOS
Determinar:

Características de células híbridas CDtumor generadas por electrofusión.

Requisitos para inmunoterapia efectiva
con híbridos células CD-tumorales.

Uso de CD singénicas frente a alogénicas
para la electrofusión.

Efectividad de inmunoterapia en tumores
establecidos en diferentes órganos.
MATERIALES Y MÉTODOS



Ratones hembras B6 y Balb.
Tumores. Fibrosarcomas MAC 205 y H12.
H12 es un clon del MAC205 que presenta crecimiento estable. Las células
cultivadas H12 son utilizadas para electrofusión y las MCA205 para
establecer tumores
Electrofusión de células dendríticas y
células tumorales H12. Las células dendríticas son
generadas desde el bazo de Ratones B6 o Balb/c.
Electrofusión de CD y tumorales poniendo células en una cámara de fusión
y sometidas a dielectroforesis.

Análisis mediante citometría de flujo.
Inmunofluorescencia directa
MATERIALES Y MÉTODOS

Inmunoterapia activa.
1. Se establecen tumores en ratones mediante inoculación de células
tumorales
I.V.
MTS pulmonares
Transcraneal
Tumor intracraneal
S.C.
Tumor piel
2. Inmunoterapia:
Inyección intraesplénica de células de fusión.
En algunos casos inyección intranodal.
En otros inyección intraperitoneal + adyuvante:OX-40RmAb.
En algunos casos aladyuvante fue 4-1BBmAb.
MATERIALES Y MÉTODOS
3. Valoración de eficacia terapeútica:
Metástasis pulmonares: los ratones son sacrificados el día 18, se
tiñen los pulmones y se hace recuento de número de nódulos
pulmonares.
Tumores subcutáneos: se mide el diámetro de los nódulos 2 veces
por semana y se introducen los datose n una curva de
crecimiento.
Tumores intracraneales: monitorización del tiempo de supervivencia
MATERIALES Y MÉTODOS

Deplección de células T
Inyeción i.v. De líquido ascítico contiene ratIgG2b mAb, que es un
Ac frente a Cd4 murino o CD8.

Análisis estadístico
RESULTADOS
1. Características de células híbridas CDtumor generadas por electrofusión.



CD generadas desde bazo de ratones mostraron fenotipo maduro
característico con alta expresión de MHC-I y II, moléculas
coestimuladoras CD80 y CD86 así como molécula de adhesión
ICAM-I(CD54) en su superficie.
Células tumorales marcadas con CFSE y CD marcadas con PEconjugado mAbs . Las células de fusión presentan doble
positividad.
La electrofusión ha generado 40-60% de células híbridas
RESULTADOS
2. Requisitos para inmunoterapia
efectiva con híbridos células CDtumorales.

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
1 inyección intraesplénica de células de fusión suficiente para
reducir el número de nódulos metastásicos
La terapia eficaz requiere coadministración de adyuvantes:
inyección de OX-40R o 4-1BB mAbs intraperitoneal
Electrofusión requiere mezcla de CD y tumorales sometidas a una
incubación prolongada.
RESULTADOS



Solo CD+tumor son capaces de inducir una respuesta terapeútica
inmune.
La inyección intraesplénica de híbridos eran eficaces. Una terapia
exitosa requiere de la inyección de vacuna dentro de órganos
linfoides, bazo o GL.
La vía I.P. o s.c. era ineficaz. Analizar la vía i.v. para vacunación no
fue factible ya que elevado tamaño de células fusión daba lugar a
embolia pulmonar y muerte del receptor.
RESULTADOS
3. Uso de CD singénicas frente a
alogénicas para la electrofusión.


La actividad significativa antitumoral fue observada solo en ratones
tratados con CD singénicas.
La participación de CD4 y CD8 es necesaria para obtener una
inmunoterapia eficaz con células de fusión.
RESULTADOS



Los ratones quefueron depleccionados de células CD4 o CD8 con la
admón. de CD4 o CD8 mAbs i.v. el día previo a la vacunación no
presentaron efectos antitumorales tras la vacunaicón.
MHC-I y MHC-II en CD4 y CD8 son necesarios para que exista un
efecto terapeútico de la inmunoterapia con células de fusión.
La deplección de células T se relaciona con ineficacia de la
inmunoterapia..
RESULTADOS
4. Efectividad de inmunoterapia en tumores
establecidos en diferentes órganos.

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

Tumor en piel: se observó retraso del crecimientotumoral en 6 de 10
ratones tratados.
Tumor intracraneal: se observó una supervivencia prolongada en 3 de 6
ratones tratados.
3 ratones curados de tumor intracraneal son sometidos 60 días
después a una nueva inoculación de tumor. No desarrollaron un
nuevo tumor, mientras que el grupo control moría a los 20 días
por tumor intracraneal. Se concluye que las células de fusión
CD-tumor inducen memoria inmunológica a largo plazo.
La eficacia de la inmunoterapia requiere utilización de CD y
adyuvante
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES



La fusión de membranas es un paso fundamental en
multitud de procesos celulares tal como:
exocitosis, endocitosis, fertilización, mitosis,
miogénesis.
La fusión celular inducida por agentes químicos ha
proprocionado un modelo útil para conocer el
proceso de fusión celular. En este estudio se
expone que la fusión celular tambien se puede
llevar a cabo sometiendo a células a campos
eléctricos.
La electrofusión no requiere sustancias fusógenas
y el proceso es sincrónico e instantáneo.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES


Si dos células están en contacto durante el
proceso de depresión de membrana lamformación
de poros microscópicos que se produce lleva a la
formación de canales y finalmnete a la formación
de una célula híbrida esférica.
Los autores sometieron a las células a corriente
eléctrica alterna para inducir un bipolo eléctrico
en la célula. Este proceso se denomina
dielectroforesis.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES



Se demuestra la eficacia de la electrofusión para
crear híbridos de fusión CD-tumor,
terapeúticamente eficaces, en el tratamiento de
tumores químicamente inducidos.
Las células de fusión CD-tumor tienen la propiedad
posibilidad de estimular las células TCD4 y CD8; la
respuesta de las células T va a mediar en la
regresión tumoral.
Los híbridos eficaces son los generados desde CD
singénicas.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES




Se demuestra la eficacia de la electrofusión para
crear híbridos.
La inmunoterapia eficaz requiere administración de
células de fusión más adyuvantes así como la
presencia de células T CD4 y CD8.
OX-40R y 4-1BBmAb son eficaces adyuvantes.
La mayor eficacia de la inmunidad inducida frente
al tumor se logra con la vacuna inoculada en bazo.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES


La eficacia terapeútica de la inmunoterapia se
demuestra para tumores establecidos en el pulmón,
pero no así frente a los tumores intracraneales.
El SNC es considerado privilegiado desde el punto
de vista inmunológico, ya que carece de drenaje
linfático y la naturaleza de la barrera
hematoencefálica con uniones intercelulares
supone una barrera física al paso de agnetes
químicos, anticuerpos y células.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
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

La electrofusión de las células tumorales
irradiadas son la fuente de obtención de Ag
tumorales.
Las células tumorales tambien continen Ag
presentes en tejidos normales, lo que limita su uso.
La electrofusión comparada con otros métodos de
fusión es un proceso que permite obtener
numerosas células de elevada eficacia y con fácil
reproductibilidad.
ENSAYOS CLÍNICOS CON VACUNAS
ANTITUMORALES
VACUNA
CANCER
TIPO DE ENSAYO
Péptidos sintéticos de epitopos de Ig de
Linfocitos B tumorales
Leucemia Linfocítica
Fase1
Células autólogas tumorales de
colon con BCG con estimulante
inespecífico
Colon
Fase3
Lisado polivalente de células de
melanoma; adyuvante Detox
Melanoma
Fase3
Ag múltiples procedentes de
cuatro líneas celulares de
melanoma; ady. alumbre
Melanoma
Fase3
Células de melanoma irradiadas
Melanoma
Fase3
Ag clonado, Jen CRG
Colorrectal y pulmón
Fase1