Proteínas de fusión
• 2 problemas principales con la
expresión de proteínas foráneas
– Degradación
– Purificación
Proteínas de fusión
• Degradación
– produce un nivel bajo de expresión
– es dificil la purificación de la proteína
deseada
• Una solución para la degradación
– Unir la proteína target a una proteína
celular estable (tag o carrier)
Proteínas de fusión
• Proteína de fusión (a nivel DNA o genes)
– Región que codifica una proteína celular
fusionada en marco de lectura a la región que
codifica para la proteína target
– Cuando se transcribe y traduce genera una
proteína de fusión
Proteínas de fusión
Carrier o tag
• en el extremo -NH2 o –COOH de la proteína
- un dominio con actividad catalítica
- un dominio antigénico
- una señal peptídica topogénica
• protege de proteólisis a la proteína de interés
• mejora la solubilidad de la proteína
• estabiliza a la proteína de interés
Proteínas de fusión
stable gene
gene of interest
MET ... LEU ARG THR MET VAL ILE ... End
ATG ... GTG CGA ACC ATG GTG ATC ... TAG
Nco I
Note: translation stop of cellular gene must be removed
Note: reading frame of fusion protein must be contiguous
Proteínas de fusión
• Clivado por proteasas
– Clivan una corta y definida secuencia de
aa
– La secuencia de clivado para la proteasa
entre el gen carrier y el gen de interés
protease cleavage sequence
fusion partner
gene of interest
Sitio de clivado para el Factor Xa
Purificación de proteínas de
fusión
• La proteína de fusión se une a una
molécula pequeña o anticuerpo (Ab)
• La molécula pequeña o Ab pueden
estar unidos a una matriz inerte
• La proteína de fusión se unirá, las otras
no
• La proteína purificada se eluirá de la
columna
Purificación por cromatografía de afinidad
3
1
2
4
Proteínas de fusión
• A veces la sobreexpresión puede
reducir la cantidad de proteína
recuperada
– La proteína forma agregados insolubles:
Cuerpos de inclusión
– La formación de agregados puede deberse
a un plegamiento incorrecto
Proteínas de fusión
• Soluciones a la formación de cuerpos
de inclusión
• proteína de fusión con tioredoxina
(soluble)
• Proteína de fusión con péptido señal,
por ej. de la fosfatasa alcalina
(periplasma)
• Tratamiento con agentes caotrópicos
(urea, cloruro de guanidinio)
pRSET Expression Vector
The pRSET vector is designed for high-level
prokaryotic expression controlled by the strong
bacteriophage T7 promoter. Expression is induced
by the production of T7 RNA polymerase in the
BL21(DE3)pLysS host E. coli cells. These cells also
produce T7 lysozyme to reduce basal expression of
target genes. The pRSETvector offers:
•High-level expression from the bacteriophage T7
promoter
•T7 gene 10 sequence to provide protein stability
•N-terminal polyhistidine (6xHis) tag for rapid
purification with ProBond® resin
•N-terminal Xpress® epitope for protein detection
with the Anti-Xpress® Antibody
•Enterokinase cleavage site for removal of fusion
tag
•f1 origin for ssDNA rescue to allow easy
sequencing and mutagenesis
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