TRANSFECCIONES
Maestría en
Biología Molecular Médica
2006
• La introducción de DNA en las células
procariontes y levaduras se llama
Transformación
• La transformación de células eucariontes
superiores se refiere a cambios en las
características del cultivo celular
• Por ello se utiliza el término transfección
para denominar la entrada de DNA foráneo
a la célula
Fibroblastos humanos
COS
Cultivos celulares
• Cultivos primarios
• Lineas celulares establecidas
Por transformación con oncogenes
Provenientes de tumores
Curva de cultivos celulares
Germinales (telomerasa activa)
T
R
F
Somáticas (telómeros se acortan
telomerasa inactiva)
Células inmortales
Extensión
(tel.activa)
de la vida celular
senecencia crisis
Divisiones celulares
TRANSFECCIONES
OBJETIVOS
•Expresión de proteínas para su purificacón
•Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el
fenotipo celular
•Estudio de promotores y elementos regulatorios
•Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del
RNA, postraduccionales, etc.
•Interacción de proteínas
•Clonado
•Terapia génica
Problemas que pueden surgir de
expresar proteínas en sistemas
procariontes
–
–
–
–
Inestabilidad
Sin actividad biológica
Contaminantes procariontes
Características bioquímicas diferentes
Modificaciones postraduccionales
imcompletas o ausentes
– Clivaje proteolítico
– Glicosilación
– Alteraciones de los aminoácidos
• fosforilación
• acetilación
• Sulfatación
• Adición de ácidos grasos
Métodos de Transfección
Depende del tipo celular
HeLa, HEK 293T, COS7,
Liposomas
alta eficiencia, no-tóxico
e.g. Lipofectamine Plus (Invitrogen), Tfx20 (Promega)
Fosfato de calcio
simple, baja eficiencia
DEAE-dextrano
simple, alta efficiency, no
para estable
Electroporación
alta eficiencia, altos niveles de
muerte
Microinyección
laborioso, alta eficiencia
Biobalística
para células vegetales
Retrovirus
muy eficiente, trabajoso
Liposomas: mezcla
Moléculas lipídica catiónicas
(N,N,N´,N´-tetramethylN,N´-bis(2-hydoxyethyl)2,3-di(oleoyloxy)-1,4butane-diammonium iodide)
Y de un lípido neutro Ldioleoyl
phosphatidylethanolamine
(DOPE).
Electroporación
Electroporación para células pegadas
Biobalística
Microinyección
Métodos de transfección
Vectores de expresión eucariontes
• Elementos para clonado en bacterias
• ori de replicación
• Marcador de selección bacteriano
• Sitios múltiples de clonado
Elementos específicos de vectores
eucariontes
_
–
–
–
–
–
–
–
Promotor eucarionte
Señal de poliadenilación
Secuencias Kozak y codón ATG
Intrón
Tags-proteínas de fusión
ori de replicación eucarionte como el de SV40
(opcional)
Marcador de selección para células eucariontes
(para transfecciones estables)
Segmentos de DNA para recombinación
homóloga
Vector de expresión eucarionte
Promotores eucariontes
Constitutivos:
- SV40
- RSV
- CMV
- hEF-1a
- Ubc
Inducibles:
- Tet o T-Rex inducilbe por tetraciclina
- Olac inducible por IPTG
- Metalotioneína inducible por metales pesados
- GAL4-E1b inducible por mifepristona
Tags
•
•
•
•
•
•
•
Glutation-S-transferasa
His
V5
Hemoaglutinina (HA)
Myc
Flag
EGFP
Elementos de control de la
traducción
Región transcribible del gen
5’ leader
1
2
3
4
5
1 2 3 4
gen de interés
5
3’ trailer
AUG (secuencia Kozak = CCRCCAUGG)
Secuencia señal de secreción
Tag para su purificación
Sitio de clivaje proteolítico
Señal de poliadenilación
Transfección transiente
(48-72 horas)
•Análisis rápido
•Múltiples propósitos
•Análisis de secuencias regulatorias
Vector de expresión
Vector de expresión
Proteínas producidas en cultivos de
células eucariontes
•
•
•
•
•
•
•
•
Proteína
Factor IX & VIIIc
CD4 receptor
erythropoetin
b & g interferons
Interleukin-2
growth hormone
tissue plasminogen activator
attack/stroke
• Hepatitis B surface antigen
• monoclonal antibodies
Condición
hemophiliacs
AIDS
cancer
cancer
cancer
dwarfism
heart
vaccine
various
Vector de fusión a EGFP
Vector de fusión a ZsYellow
Expresión de proteínas fluorescentes
Proteína fluorescente verde
Vector de anclaje a membrana de la
proteína
Vector de secreción de la proteína
Dos vectores de expresión diferentes
El número de copias de cada plásmido puede
ser diferente
La expresión de cada proteína puede ser
diferente
Vectores que expresan dos genes
Cada gen es una unidad transcripcional y tiene
su promotor y secuencia de poliadenilación
Pueden no expresar la misma cantidad de protína
Vectores dicistrónicos
–
–
–
–
–
Posee un solo promotor
2 genes a partir de la misma unidad transcripcional
Se sintetiza un solo mRNA
Necesita un sitio interno de unión al ribosoma
IRES proviene del genoma de virus de mamíferos
Vectores dicistrónicos
ANALISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA
5’
3’
PROMOTOR
exón 1
intrón
exón 2
transcripción
Gen reportero
para análisis
de
promotores
5’
mRNA
m7GpppN
3’
AAAAAA
La mayoría de los cambios en los niveles de
mRNA ocurren por variaciones en la
transcripción.
Estrategia de genes reporteros
Los genes reporteros son secuencias que
codifican para proteínas de simple detección. Se
usan para reemplazar productos génicos difíciles
de medir y determinar actividad promotora.
5’
PROMOTOR
PROMOTOR
exón 1
intrón
GEN REPORTERO
e.g. luciferasa
exón 2
3’
Genes reporteros
CAT (cloramfenicol acetiltransferasa)
Transfiere grupos acetilos marcados 14C o 3H al cloramfenicol.
La detección se da por cromatografía en capa delgada o extracción
orgánica
GAL (-galactosidasa)
Hidroliza sustrato incoloro (ONPG) para dar producto amarillo que
se cuantifica
SEAP (secreted human placental alkaline phosphatase)
Ensayo de fosfatasa alcalina bioluminiscente. Muy sensible
LUC (luciferasa)
Oxida a la luciferina emitiendo fotones. Los fotones se cuentan en
un luminómetro o una cámara de recuento de fotones (ensayo in
vivo). Hay diferentes luciferasas dispoinibles
GFP (green fluorescent protein)
Fluoresce por irradiación con UV – se observa con microscopio de
fluorescencia.
Vector para analizar secuencias promotoras.
Vector para analizar secuencias promotoras.
Vector control-secuencias regulatorias
Vector control-secuencias regulatorias
Ensayo de genes reporteros
Diseño y construcción del vector
Introducción en células por
transfección transiente o estable
Ensayo de actividad
Gen control
Gen reportero
(ej -galactosidasa)
(ej luciferasa)
Cálculo de actividad
promotora
Vector control de eficiencia de transformación
Vector control de eficiencia de transformación
Co-transfección de genes reporteros
Dual Luciferase Assay system - Promega
Se clona el promotor de interés delante del gen de luciferasa
(firefly) y se usa la luciferasa de Renilla como control interno
La luciferasa de
Renilla se expresa de
un promotor
constitutivo
e.g.
SV40 I/E
HSV TK
Ejemplo de resultado
Effect of inhibitors/activators on CRT promoter-driven luciferase
expression.
3.17
3.5
2.94
2.72
2.5
2
1.64
1.21
1.5
1
1.37 1.46
0.98
1.15 1.12
1
0.5
0
co
nt
ro
l
ge
n
ge 5
n
50
ty
rA 0
25
ty
rA 50
25
H2 500
O
2
H2 1 00
O
2
15
0
NA
C
NA 1
C
2.
5
VA
N
VA 50
N
20
0
relative f/r luc
expression
3
treatment
Analisis de una región promotora
Qué secuencias están involucradas en la
regulación?
Análisis de genes reporteros y análisis por
deleción
CIS -acting elements
Elementos de respuesta
Qué proteínas se unen a estos elementos?
Análisis de DNase I footprinting
Ensayo de retardo en gel
CHIP
TRANS -acting factors
e.g. factores de transcripción específicos
Interacción de proteínas:
Doble híbrido en células de
mamífero
pBIND
pACT
pG5/luc
Ejemplo de resultados
Transfección estable
• Por integración
• Por recombinación homóloga
• Como episoma
• Requiere de un marcador de selección en el
vector
• Util para estudios que impliquen inducción
de la expresión
Marcadores de selección eucariontes
• Agent
•
•
•
•
•
•
Action
Blasticidin S Inhiben síntesis
Hygromycin B
proteica
Puromycin
G-418
Zeocina
Intercalante del DNA
MTX
Inhibits DNA syn.
Marker Gene
BlasticidinS deaminase
Gen hyg o hph
Neomycin phosphotransferase
gen Sh ble, se une
Dihydrofolate reductase
Marcadores de selección
• Metotrexate (MTX)
– Mata a las células que carecen de dihidrofolato reductasa
– La línea celular huesped debe ser DHFR– El vector contiene el gen DHFR
– Incrementos en [MTX] aumenta el número de copias génicas
• G418 (Geneticina)
– Bloquea la traducción
– La resistencia es la neomicina fosfotransferasa ( Neor )
– Para células de mamífero, plantas y levaduras
• Zeocina
- Antibiótico de la familia bleomicina
- Cliva el DNA
- El producto del gen ble se une e impide el pegado al DNA.
-de amplio espectro (mamíferos, levaduras y bacterias)
Vector episomal
Sistema de recombinación homóloga
• Flp-in Invitrogen: Recombinación sitio específica
de Saccharomyces cerevisiae
• Sitio FRT (Flp recombination target)
• Recombinasa Flp
Vector que contiene el sitio FRT
Pasos de recombinación homóloga
1- Generar línea que posea el sitio FRT
Vector de clonado del gen de interés
Vector de clonado del gen de interés
Vector de expresión de la
recombinasa
2- Cotransfectar con vector con gen de interés y
vector de expresión para recombinasa
Resultado
Sistema siRNA
Estrategias siRNA
Vector siRNA
Sistema reprimible por tetraciclina
Sistema inducible por tetraciclina
Vector de expresión del regulador
Vector de expresión del regulador
Vector de clonado del gen de interés
Vector de expresión para dos genes
regulados por tet
Vector de expresión de proteínas
en leche
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