Sistemas de Expresión
Génica
Objetivo
Conocer el diseño de una estrategia para
expresión de proteínas
Conocer los sistemas de expresión génica
en bacterias, levaduras e insectos.
Diseño de una estrategia para expresión de proteínas
Elección del vector
Aplicación u objetivos experimentales con la proteína expresada
Información conocida de la proteína.
Selección de la estrategia de clonado: solubilidad/localización
subcelular/fusión a tags/regulación de la expresión.
Preparación del vector
corte con ER/desfosforilación/purificación
Preparación del inserto de DNA
plásmido y/o PCR/corte con ER/purificación
Clonado del inserto dentro del vector
Ligación/transformación en huesped/identificación.
De clones positivos/verificación del producto clonado por secuenciación.
Transformación dentro del huesped para expresión.
Inducción y optimización de la expresión de la proteina de interés
análisis cuantitativos de niveles de expresión y actividad biológica.
Scale-up
Purificaión de la proteína y análisis funcional
Sistemas de expresión de proteínas
Sistema
Vel de crecimiento/
Costo
Nivel de
expresión
Modificaciones posttraduccionales
E. coli
30 min.
Bajo
Alto
NO
Levaduras
90 min
Bajo
Medio
 glicosilación
18-24 hs.
Alto
Medio
24 hs
Alto
Bajo
Células insectos
Células mamíferos
Alta manosa
 glicosilación
(largo, contenido manosa)
Si
Sistema de expresión en
bacterias
Manipulación de la expresión
génica en bacterias
• El objetivo principal de la ingeniería genética con fines
industriales es lograr la correcta expresión a altos
niveles del gen clonado en el microorganismo huésped
elegido.
• Sin embargo, la clonación directa (sin manipulación
adicional) de un gen en un vector normal (ej. como el
pBR322) no suele asegurar que nuestro gen de interés
se vaya a expresar bien, sobre todo cuando procede de
especies alejadas filogenéticamente. Por esta razón hay
que proceder al diseño de vectores especializados y a
menudo a modificaciones del gen de interés, con objeto
de que este pueda transcribirse y traducirse bien en el
microorganismo huésped.
Elementos a considerar para determinar
el sistema de expresión adecuado
 Naturaleza de las secuencias de inicio y final de la transcripción
(promotores-operadores, terminadores)
 Señales para el comienzo de la traducción
 Eficiencia de la traducción
 Estabilidad de la proteína en la célula huésped
 Localización celular de la proteína a expresar
 Número de copias del gen clonado.
Lo que debe tener un vector de
expresión en E. coli
 Un promotor eficiente, dotado de las regiones conservadas –35 (TTGACA
o parecida) y –10 (TATAAT o parecida)
 A corta distancia del promotor, una región que al transcribirse suministre el
sitio de entrada al ribosoma: la denominada secuencia de Shine-Dalgarno,
que es complementaria del extremo 3’ del ARNr 16S
 A unos 3-11 pb aguas abajo (dowstream) de la secuencia de ShineDalgarno, debería situarse el codón ATG que señala el comienzo de la
traducción del ARNm. Este codón lo puede suministrar el gen a clonar, o
bien el vector puede disponer de ese codón, seguido de alguna diana que
permita la inserción del gen a expresar
 Finalmente, y situado al lado 3’ de todo lo anterior, una secuencia que
funcione como terminador de la transcripción (que en su forma de ARN
constituye la típica horquilla por emparejamiento, donde la ARN polimerasa
se desliga del ARN recién formado).
Ejemplos de promotores
regulables en E. coli
– Derivados del promotor lac
– Derivados del promotor trp
– Promotor híbrido artificial tac
– Promotores derivados del fago 
– Promotor del fago T7
Promotores fuertes y
regulables
 Expresar un gen a alto nivel, no siempre deberíamos escoger un
promotor fuerte y constitutivo.
 Sin embargo, la mayor parte de las veces no conviene usar tal tipo de
promotores, porque al estar expresando permanentemente el gen de interés a
alto nivel, pueden sustraerse recursos para el normal crecimiento de las células.
 Esto es especialmente delicado si la proteína foránea tiene efectos negativos
para el huésped.
 Por lo tanto, lo normal es emplear promotores regulables, que el
investigador puede conectar y desconectar a voluntad.
 Una estrategia habitual es aquella en la que se cultiva la bacteria recombinante
hasta que se logran grandes densidades, momento en que se suministra la
señal para que el promotor se active y transcriba el gen insertado.
Elección del sistema de expresión en E. coli
1) Tamaño de la proteína:
< 100 aminoácidos: estables como proteínas de fusión.
>100 aminoácidos: inestables van a cuerpos de inclusión.
Cuerpos de inclusión: agregados insolubles intracelulares.
Ruptura células (sonicación)--- solubilización y refolding (Urea 8 M)---Diálisis
2) Cantidad de proteína:
- Poca cantidad (screening de mutantes): plásmidos de expresión standard
- Grandes cantidades: Explorar varios sistemas-huésped y esquemas de
purificación.
3) Proteínas activas: considerar la formación de cuerpos de inclusión.
Proteínas expresadas en E. coli
1) Proteínas de fusión:
Región que codifica una proteína “tag” fusionada en marco de lectura a la región que
codifica para la proteína target.
Cuando se transcribe y traduce genera una proteína de fusión
purificación
protege de proteólisis a la proteína de interés
mejora la solubilidad de la proteína
estabiliza a la proteína de interés
Esquema genérico del vector
A
Promotor
ATG
A
B
MCS
B
ori
Ampr
MCS
Secuencia “tag”:
*Dominio con función enzimática
*Señales topogénicas
Secuencias consenso para
Corte con una proteasa
Sitio múltiple de clonado
Construcción de una proteína de fusión
Fusion partner
gene of interest
MET ... LEU ARG THR MET VAL ILE ... End
ATG ... GTG CGA ACC ATG GTG ATC ... TAG
Nco I
Note: translation stop of fusion partner gene must be removed
Note: reading frame of fusion protein must be contiguous
Secuencias consenso para el corte con una proteasa
– Clivan una secuencia corta y definida de aa
– La secuencia de clivado para la proteasa está entre el gen carrier y el gen de interés
protease cleavage sequence
fusion partner
gene of interest
Esquema general purificación de proteínas de fusión:GST
GST
Proteína
2-
Glutation
13-
4- Elution
Corte con proteasa
Optimización de la expresión de proteínas en E. coli
1)
Iniciación de la traducción: Promotor fuerte producirá altos niveles de mRNA
Se requiere optimizar la traducción.
Secuencia de Shine Dalgarno:
Secuencia complementaria a región en
16S rRNA (subunidad pequeña del
ribosoma)
Secuencia 6-8 nt a -10 nt del AUG
mRNA
5’
UAAGGAGG
AUUCCUCC
3’ 16S rRNA
AUG
5’
small ribosomal subunit
3’
2) Uso de codones: El código genético es redundante, usa 61 codones para 20 aa.
Los codones (excepto Met y Trp con 1 codón c/u) que codifican para un aa no son
usados con igual frecuencia. Algunos codones usados infrecuentemente=↓[RNAt]
Codon
Aminoácido
Frec. uso en E.
coli
Frec. uso en
humanos
GAG
Glutámico
0,3
0,59
GAA
Glutámico
0,7
0,41
CCG
Prolina
0,55
0,11
CCA
Prolina
0,20
0,27
CCU
Prolina
0,16
0,29
CCC
Prolina
0,10
0,33
Cepa RosettaTM: cepa diseñada para
aumentar la expresión de proteínas
eucariotas que poseen codones de
baja frecuencia en E.coli.
3) Estructura del mRNA:
Región del codón de iniciación AUG en extremo 5’ del mRNA
no debe ser complementaria a sí misma, podría bloquear el movimiento del
ribosoma y evitar la traducción
4) Cepas deficientes en proteasas: Lon y OmpT
Elección del promotor
Promotores basados en el operón Lac:
1) Promotor Lac
Lac promoter
pGEM®-3Z Vector sequence reference points.
T7 RNA polymerase transcription initiation site 1; multiple cloning region 5-61
SP6 RNA polymerase promoter (.17 to +3) 67-86; SP6 RNA polymerase transcription initiation site 69
lac operon sequences 94.323; 2564-2724
binding site of pUC/M13 Reverse Sequencing Primer 104-125
lacZ start codon 108; lacZ operator 128-144
β-lactamase (Ampr) coding region 1265-2125
binding site of pUC/M13 Forward Sequencing Primer 2677-2700
T7 RNA polymerase promoter (-17 to +3) 2727-3
Cepa huesped: lacZDM15. Expresa LacIq
2) Promotores tac y trc: 3x más fuertes que trp y 10x más fuertes que lac
•
•
•
Híbrido de promotores lac y trp
Regulado por el represor lac
Independiente de la regulación por cAMP
Gen de interés
XXXXXXXXXXXXXXXXXX
-35 promotor trp
-10 promotor lac
Separación
16 pb=promotor tac
17 pb=promotor trc
Ptac promoter
: terminador de la transcripción
Promotor Ptac/IPTG:
Polylinker:
MalE: secuencia señal de la proteína Maltosa Binding Protein (MBP), periplásmica con alta
afinidad por maltosa.
3) Promotores basados en el gen 10 del bacteriófago T7:
Todos los promotores del fago T7 (incluído el gen 10) requieren la T7 RNA Polimerasa para
expresarse
Inducer
El gen de la T7 RNA Pol
puede estar bajo el
control del promotor lac
en genómico de E.coli
T7 RNA Pol
lac pro T7 RNA Pol
Protein of
Interest
T7 RNA Pol
El gen de interés puede
estar bajo el control del
promotor del gen 10
g10 pro gene of interest
T7 promoter
pRSET Expression Vector
The pRSET vector is designed for high-level prokaryotic
expression controlled by the strong bacteriophage T7
promoter. Expression is induced by the production of T7
RNA polymerase in the BL21(DE3)pLysS host E. coli
cells. These cells also produce T7 lysozyme to reduce
basal expression of target genes. The pRSETvector offers:
•High-level expression from the bacteriophage T7
promoter
•T7 gene 10 sequence to provide protein stability
•N-terminal polyhistidine (6xHis) tag for rapid purification
with ProBond® resin
•N-terminal Xpress® epitope for protein detection with the
Anti-Xpress® Antibody
•Enterokinase cleavage site for removal of fusion tag
•f1 origin for ssDNA rescue to allow easy sequencing and
mutagenesis
4) Promotores basados en el promotor del bacteriófago  pL:
Transcription
No tryptophan
PO
Ptrp
cI repressor
Bacterial Chromosome
cI repressor
No transcription
PO
PL
ATG-GENE
pLEX vector
Tryptophan
trp repressor
PO
No transcription
Ptrp
cI repressor
Bacterial Chromosome
Transcription
PO
PL
ATG-GENE
pLEX vector
Mechanism of transcriptional regulation with pLEX
PL promoter- triptofano
Problemas cuando se expresan proteínas eucarióticas en cél procariotas:
• Inestables.
• Sin actividad biológica.
• Contaminantes procarióticos.
Soluciones: se han desarrollado sistemas de expresión en eucariotas
• Esp. importantes para proteínas terapéuticas.
• Necesidad de que tengan idénticas propiedades bioquímicas, biofísicas y
funcionales a la proteína natural.
Modificaciones post-traduccionales
– Formación de uniones disulfuro correctas.
– Clivaje proteolítico del precursor inactivo.
– Glicosilación- agregado de residuos de azúcar
– Alteración de aminoácidos en la proteína: fosforilación, acetilación,
agregado de grupos sulfato, agregado de ácidos grasos
Producción de proteínas
recombinantes en células eucariotas
• Problemas que suelen aparecer cuando
proteínas eucarióticas se expresan en cél
procariotas
– inestables
– sin actividad biológica
– contaminantes procarióticos
Sistemas de expresión eucariotas
• Para eliminar los problemas de expresión
en procariotas, se han desarrollado
sistemas de expresión eucariotas
– Esp. importantes para proteínas terapéuticas
– Necesidad de que tengan idénticas
propiedades a la proteína natural :
bioquímicas biofísicas funcionales
Sistemas de expresión eucariotas
• Cuál es la diferencia?
– Modificación post-traduccional de la mayoría
de las proteínas eucariotas
– Cél procariotas no pueden realizar estas
modificaciones
Modificaciones posttraduccionales
–
–
–
–
Formación de uniones disulfuro correctas
Clivaje proteolítico del precursor inactivo
Glicosilación- agregado de residuos de azúcar
Alteración de aminoácidos en la proteína
• fosforilación
• acetilación
• agregado de grupos sulfato
• Agregado de ácidos grasos
Sistemas de expresión en
levaduras
Sistemas de expresión en levaduras:
ventajas
– Organismo unicelular
– Bien caracterizadas genética y fisiológicamente
– Promotores fuertes disponibles
– Plásmido natural (2µm)
– Eucariotas, ocurren modificaciones posttransduccionales
– Segregan algunas proteínas
– No patógeno
Vectores de levaduras
• YIp: integrativos
- una copia integrada a un cromosoma
• YEp: episomales
- ori 2m (alto número de copias)
• YCp: centroméricos
-ARS, CEN (1 o 2 copias por cél)
Todos tienen marcador de auxotrofia y son
shuttle
Vectores episomales
– Son ampliamente usados
– A menudo inestables en cultivos a gran escala
(>10L)
– Estrategia - alterar las condiciones de crecimiento
para estabilizar el vector episomal
• usar cepas mutantes que requieren nutrientes específicos.
– Leucina, Triptofano, Histidina
• el gen que provee el fenotipo salvaje se encuentra en el
plásmido episomal
Promotores de levaduras
Promoter
Acid phosphatase
Alcohol dehydrogenase I
Alcohol dehydrogenase II
Galctokinase
Metallothionein
Phosphoglycerate kinase
Triose Phosphate isomerase
Status
PHO5
ADH I
ADH II
GAL 1
Cup 1
PGK
TPI
Inducible
Constitutive
Inducible
Inducible
Inducible
Constitutive
Constitutive
Sistemas de expresión en
levaduras: desventajas
– Inestabilidad de plásmidos en gran escala
• Vectores episomales
– Superglicosilación de glicoproteínas
• 100+ residuos manosa vs. 8-13 normal
• puede alterar la actividad de la proteína
– Proteínas secretadas quedan atrapadas en
periplasma (entre la membrana y la pared
celular)
• se usan señales peptídicas
Soluciones a los problemas en
sistemas de expresión en levaduras
• Levaduras modificadas genéticamente para
llevar a cabo glicosilación = humanos
– Science Vol 301, p1244-1246 (29 Aug 2003)
• Deleción de genes de glicosilación de levaduras
• Agregado de genes de glicosilación humanos
Soluciones a los problemas en
sistemas de expresión en levaduras
• Usar otro tipo de levaduras
– Pichia pastoris
– Hansenula polymorpha
– No sólo Saccharomyces cerevisiae
• Usar otros eucariotas
– Cél de insectos
– Cultivos de cél de mamíferos
Levaduras como sistema de expresión
• Rápido crecimiento, bajo costo similar a E coli.
• Modificaciones postraduccionales escenciales para la función proteica.
• Problema (difieren de eucariotas superiores): forma de N-glicosilación y Oglicosilación: uso de levaduras con N-gycosilación humanizada.
Saccharomyces cerevisiae
• Económico, bioseguro para aplicaciones humanos.
• Posee características bioquímicas, genéticas, similiar a eucariotas superiores.
• Es adaptable a fermentación gran escala.
• Herramienta para estudios de complementación.
•otros Pichia pastoris y Hansenula polymorpha.
Vectores de levaduras
Tipos de vectores
• YIp: integrativos: una copia integrada al cromosoma
• YEp: episomales: ori 2m (alto número de copias)
• YCp: centroméricos: ARS, CEN (1 o 2 copias por cél)
Promotores
Promoter
Acid phosphatase
Alcohol dehydrogenase I
Alcohol dehydrogenase II
Galctokinase
Metallothionein
Phosphoglycerate kinase
Triose Phosphate isomerase
Status
PHO5
ADH I
ADH II
GAL 1
Cup 1
PGK
TPI
Inducible
Constitutive
Inducible
Inducible
Inducible
Constitutive
Constitutive
Vectores episomales
Vectores centroméricos
Expresión de proteínas en Pichia pastoris
1) Requiere técnicas simples para la manipulación genética (similar a S. cerevisiae)
2) Producción de altos niveles de proteínas (intra y extracelular)
3) Modificaciones post-traduccionales: glicosilación, puente disulfuro, procesamiento
proteolítico.
4) Kits de expresión disponibles.
5) Empleo del gen AOX1
Ampr, oriE: mantenimiento en E. coli
AOX1p: promotor de alcohol oxidasa.
AOX1t: secuencias terminador transcripción.
MCS: sitio múltiple clonado.
HIS4: marcador biosintético.
3´-AOX1
MCS
Diagrama general de un vector P pastoris shuttle
Integración del vector de P. pastoris
•Se integran para maximizar la estabilidad del sistema de expresión.
•Corte del vector que lleva inserto de interés flanqueado por secuencias del gen AOX1 (para recombinación
homóloga requiere regiones terminales mas largas que S cerevisiae.)
•Transformación con vector linealizado por electroporación o métodos químicos.
•Cepa huésped: his4 pep4 prb1 (auxotrófica para Histidina y deficiente en proteasas).
Inserto
Inserto
Selección en medio hisCepa resultante aox1=Muts
Metanol: crec lento, alta producción prot.
Pichia methanolica Expression System
Expresión controlada por promotor AUG1 (alcohol
oxidasa):
reprimido por glicerol o glucosa
Inducido por metanol
a-factor: péptido señal para secreción de la
proteína expresada.
V5 epítope: para detección con anticuerpos anti-V5
6xHis: tag polihistidina purificación níquel-agarosa.
ADE2: marcador biosintético.
Sistemas de expresión en
insectos
Que son los baculovirus
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Los baculovirus son un grupo de virus
encontrados mayormente en insectos
(Baculoviridae).
Tienen una estructura de varilla
(baculum=bastón), un diámetro de entre 4050
nm y una longitud de entre 200-400 nm.
Su información genética está almacenada en
una molécula de ADN doble cadena, circular,
de aproximadamente 80-200 Kpb.
Baculovirus como sistema de
expresión
Características
 Ambiente eucariota para la producción de
 proteínas
 Expresión excepcionalmente alta
 Expresión durante la fase de oclusión
 Expresión a 27ºC
 Capacidad de grandes inserciones
 Expresión eficiente de genes no
“spliceados”
 (cDNAs)
 Simplicidad de la tecnología
Asignacion
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Diapositiva 1 - Interbiotecnologia