a-complementación
Cepa E. coli LacZDM15
Expresión proteínas-BM 2009
Diseño de una estrategia para expresión de proteínas
Elección del vector
Aplicación u objetivos experimentales con la proteína expresada
Información conocida de la proteína.
Selección de la estrategia de clonado: solubilidad/localización
subcelular/fusión a tags/regulación de la expresión.
Preparación del vector
corte con ER/desfosforilación/purificación
Preparación del inserto de DNA
plásmido y/o PCR/corte con ER/purificación
Clonado del inserto dentro del vector
Ligación/transformación en huesped/identificación.
De clones positivos/verificación del producto clonado por secuenciación.
Transformación dentro del huesped para expresión.
Inducción y optimización de la expresión de la proteina de interés
análisis cuantitativos de niveles de expresión y actividad biológica.
Scale-up
Purificaión de la proteína y análisis funcional
0-Expresión proteínas-BM 2009
Sistemas de expresión de proteínas
Sistema
Vel de crecimiento/
Costo
Nivel de
expresión
Modificaciones posttraduccionales
E. coli
30 min.
Bajo
Alto
NO
Levaduras
90 min
Bajo
Medio
 glicosilación
18-24 hs.
Alto
Medio
24 hs
Alto
Bajo
Células insectos
Células mamíferos
Alta manosa
 glicosilación
(largo, contenido manosa)
Si
1-Expresión proteínas-BM 2009
Elección del sistema de expresión en E. coli
1) Tamaño de la proteína:
< 100 aminoácidos: estables como proteínas de fusión.
>100 aminoácidos: inestables van a cuerpos de inclusión.
Cuerpos de inclusión: agregados insolubles intracelulares.
Ruptura células (sonicación)--- solubilización y refolding (Urea 8 M)---Diálisis
2) Cantidad de proteína:
- Poca cantidad (screening de mutantes): plásmidos de expresión standard
- Grandes cantidades: Explorar varios sistemas-huésped y esquemas de
purificación.
3) Proteínas activas: considerar la formación de cuerpos de inclusión.
2-Expresión proteínas-BM 2009
Proteínas expresadas en E. coli
1) Proteínas de fusión:
Región que codifica una proteína “tag” fusionada en marco de lectura a la región que
codifica para la proteína target.
Cuando se transcribe y traduce genera una proteína de fusión
purificación
protege de proteólisis a la proteína de interés
mejora la solubilidad de la proteína
estabiliza a la proteína de interés
Esquema genérico del vector
A
Promotor
ATG
A
B
MCS
B
ori
Ampr
MCS
Secuencia “tag”:
*Dominio con función enzimática
*Señales topogénicas
Secuencias consenso para
Corte con una proteasa
Sitio múltiple de clonado
3-Expresión proteínas-BM 2009
Construcción de una proteína de fusión
Fusion partner
gene of interest
MET ... LEU ARG THR MET VAL ILE ... End
ATG ... GTG CGA ACC ATG GTG ATC ... TAG
Nco I
Note: translation stop of fusion partner gene must be removed
Note: reading frame of fusion protein must be contiguous
Secuencias consenso para el corte con una proteasa
– Clivan una secuencia corta y definida de aa
– La secuencia de clivado para la proteasa está entre el gen carrier y el gen de interés
protease cleavage sequence
fusion partner
gene of interest
4-Expresión proteínas-BM 2009
Esquema general purificación de proteínas de fusión:GST
GST
Proteína
2-
Glutation
13-
4- Elution
Corte con proteasa
5-Expresión proteínas-BM 2009
6-Expresión proteínas-BM 2009
Optimización de la expresión de proteínas en E. coli
1)
Iniciación de la traducción: Promotor fuerte producirá altos niveles de mRNA
Se requiere optimizar la traducción.
Secuencia de Shine Dalgarno:
Secuencia complementaria a región en
16S rRNA (subunidad pequeña del
ribosoma)
Secuencia 6-8 nt a -10 nt del AUG
mRNA
5’
UAAGGAGG
AUUCCUCC
3’ 16S rRNA
AUG
3’
5’
small ribosomal subunit
7-Expresión proteínas-BM 2009
2) Uso de codones: El código genético es redundante, usa 61 codones para 20 aa.
Los codones (excepto Met y Trp con 1 codón c/u) que codifican para un aa no son
usados con igual frecuencia. Algunos codones usados infrecuentemente=↓[RNAt]
Codon
Aminoácido
Frec. uso en E.
coli
Frec. uso en
humanos
GAG
Glutámico
0,3
0,59
GAA
Glutámico
0,7
0,41
CCG
Prolina
0,55
0,11
CCA
Prolina
0,20
0,27
CCU
Prolina
0,16
0,29
CCC
Prolina
0,10
0,33
Cepa RosettaTM: cepa diseñada para
aumentar la expresión de proteínas
eucariotas que poseen codones de
baja frecuencia en E.coli.
8-Expresión proteínas-BM 2009
3) Estructura del mRNA:
Región del codón de iniciación AUG en extremo 5’ del mRNA
no debe ser complementaria a sí misma, podría bloquear el movimiento del
ribosoma y evitar la traducción
4) Cepas deficientes en proteasas: Lon y OmpT
9-Expresión proteínas-BM 2009
Elección del promotor
Promotores basados en el operón Lac:
1) Promotor Lac
10-Expresión proteínas-BM 2009
Lac promoter
pGEM®-3Z Vector sequence reference points.
T7 RNA polymerase transcription initiation site 1; multiple cloning region 5-61
SP6 RNA polymerase promoter (.17 to +3) 67-86; SP6 RNA polymerase transcription initiation site 69
lac operon sequences 94.323; 2564-2724
binding site of pUC/M13 Reverse Sequencing Primer 104-125
lacZ start codon 108; lacZ operator 128-144
β-lactamase (Ampr) coding region 1265-2125
binding site of pUC/M13 Forward Sequencing Primer 2677-2700
T7 RNA polymerase promoter (-17 to +3) 2727-3
Cepa huesped: lacZDM15. Expresa LacIq
11-Expresión proteínas-BM 2009
2) Promotores tac y trc: 3x más fuertes que trp y 10x más fuertes que lac
•
•
•
Híbrido de promotores lac y trp
Regulado por el represor lac
Independiente de la regulación por cAMP
Gen de interés
XXXXXXXXXXXXXXXXXX
-35 promotor trp
-10 promotor lac
Separación
16 pb=promotor tac
17 pb=promotor trc
12-Expresión proteínas-BM 2009
Ptac promoter
: terminador de la transcripción
Promotor Ptac/IPTG:
Polylinker:
MalE: secuencia señal de la proteína Maltosa Binding Protein (MBP), periplásmica con alta
afinidad por maltosa.
13-Expresión proteínas-BM 2009
3) Promotores basados en el gen 10 del bacteriófago T7:
Todos los promotores del fago T7 (incluído el gen 10) requieren la T7 RNA Polimerasa para
expresarse
Inducer
El gen de la T7 RNA Pol
puede estar bajo el
control del promotor lac
en genómico de E.coli
T7 RNA Pol
lac pro T7 RNA Pol
Protein of
Interest
T7 RNA Pol
El gen de interés puede
estar bajo el control del
promotor del gen 10
g10 pro gene of interest
14-Expresión proteínas-BM 2009
T7 promoter
15-Expresión proteínas-BM 2009
pRSET Expression Vector
The pRSET vector is designed for high-level prokaryotic
expression controlled by the strong bacteriophage T7
promoter. Expression is induced by the production of T7
RNA polymerase in the BL21(DE3)pLysS host E. coli
cells. These cells also produce T7 lysozyme to reduce
basal expression of target genes. The pRSETvector offers:
•High-level expression from the bacteriophage T7
promoter
•T7 gene 10 sequence to provide protein stability
•N-terminal polyhistidine (6xHis) tag for rapid purification
with ProBond® resin
•N-terminal Xpress® epitope for protein detection with the
Anti-Xpress® Antibody
•Enterokinase cleavage site for removal of fusion tag
•f1 origin for ssDNA rescue to allow easy sequencing and
mutagenesis
18-Expresión proteínas-BM 2009
4) Promotores basados en el promotor del bacteriófago l pL:
Transcription
No tryptophan
PO
Ptrp
lcI repressor
lPL promoter- triptofano
Bacterial Chromosome
cI repressor
No transcription
PO
PL
ATG-GENE
pLEX vector
Tryptophan
trp repressor
PO
No transcription
Ptrp
lcI repressor
Bacterial Chromosome
Transcription
PO
PL
ATG-GENE
pLEX vector
Mechanism of transcriptional regulation with pLEX
17-Expresión proteínas-BM 2009
Problemas cuando se expresan proteínas eucarióticas en cél procariotas:
• Inestables.
• Sin actividad biológica.
• Contaminantes procarióticos.
Soluciones: se han desarrollado sistemas de expresión en eucariotas
• Esp. importantes para proteínas terapéuticas.
• Necesidad de que tengan idénticas propiedades bioquímicas, biofísicas y
funcionales a la proteína natural.
Modificaciones post-traduccionales
– Formación de uniones disulfuro correctas.
– Clivaje proteolítico del precursor inactivo.
– Glicosilación- agregado de residuos de azúcar
– Alteración de aminoácidos en la proteína: fosforilación, acetilación,
agregado de grupos sulfato, agregado de ácidos grasos
19-Expresión proteínas-BM 2009
Levaduras como sistema de expresión
• Rápido crecimiento, bajo costo similar a E coli.
• Modificaciones postraduccionales escenciales para la función proteica.
• Problema (difieren de eucariotas superiores): forma de N-glicosilación y Oglicosilación: uso de levaduras con N-gycosilación humanizada.
Saccharomyces cerevisiae
• Económico, bioseguro para aplicaciones humanos.
• Posee características bioquímicas, genéticas, similiar a eucariotas superiores.
• Es adaptable a fermentación gran escala.
• Herramienta para estudios de complementación.
•otros Pichia pastoris y Hansenula polymorpha.
20-Expresión proteínas-BM 2009
Vectores de levaduras
Tipos de vectores
• YIp: integrativos: una copia integrada al cromosoma
• YEp: episomales: ori 2m (alto número de copias)
• YCp: centroméricos: ARS, CEN (1 o 2 copias por cél)
Promotores
Promoter
Acid phosphatase
Alcohol dehydrogenase I
Alcohol dehydrogenase II
Galctokinase
Metallothionein
Phosphoglycerate kinase
Triose Phosphate isomerase
Status
PHO5
ADH I
ADH II
GAL 1
Cup 1
PGK
TPI
Inducible
Constitutive
Inducible
Inducible
Inducible
Constitutive
Constitutive
21-Expresión proteínas-BM 2009
Vectores episomales
Vectores centroméricos
22-Expresión proteínas-BM 2009
23-Expresión proteínas-BM 2009
Expresión de proteínas en Pichia pastoris
1) Requiere técnicas simples para la manipulación genética (similar a S. cerevisiae)
2) Producción de altos niveles de proteínas (intra y extracelular)
3) Modificaciones post-traduccionales: glicosilación, puente disulfuro, procesamiento
proteolítico.
4) Kits de expresión disponibles.
5) Empleo del gen AOX1
Ampr, oriE: mantenimiento en E. coli
AOX1p: promotor de alcohol oxidasa.
AOX1t: secuencias terminador transcripción.
MCS: sitio múltiple clonado.
HIS4: marcador biosintético.
3´-AOX1
MCS
Diagrama general de un vector P pastoris shuttle
24-Expresión proteínas-BM 2009
Integración del vector de P. pastoris
•Se integran para maximizar la estabilidad del sistema de expresión.
•Corte del vector que lleva inserto de interés flanqueado por secuencias del gen AOX1 (para recombinación
homóloga requiere regiones terminales mas largas que S cerevisiae.)
•Transformación con vector linealizado por electroporación o métodos químicos.
•Cepa huésped: his4 pep4 prb1 (auxotrófica para Histidina y deficiente en proteasas).
Inserto
Inserto
Selección en medio hisCepa resultante aox1=Muts
Metanol: crec lento, alta producción prot.
25-Expresión proteínas-BM 2009
Pichia methanolica Expression System
Expresión controlada por promotor AUG1 (alcohol
oxidasa):
reprimido por glicerol o glucosa
Inducido por metanol
a-factor: péptido señal para secreción de la
proteína expresada.
V5 epítope: para detección con anticuerpos anti-V5
6xHis: tag polihistidina purificación níquel-agarosa.
ADE2: marcador biosintético.
26-Expresión proteínas-BM 2009
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