Perspectivas
de las nuevas
técnicas de
secuenciación
NEREA GARCÍA SIERRA
La carrera hacia
el genoma de los 1000 $
• Proyecto Genoma Humano:
– 1990-2005; 3.000 millones de $.
– Finalmente: 2001; 2.000 millones de $.
• Próxima meta: secuencia completa por $1.000
 National Institute of Health, 2004: 70 millones $ para secuenciar
un genoma de mamífero
• 2009 por $ 100.000
• 2014 por $ 1.000
– Final 2007: el genoma de un mamífero por $100.000
• LIMITACIONES ACTUALES: EL COSTE
– Reducción del coste:
• Supresión de pasos preparativos
• Miniaturización de los equipos (ahorro en reactivos)
• Secuenciación simultánea de millones de moléculas
MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN:
• Secuenciación de Sanger (1977 )
– Secuenciación por separación
– Actualmente utilizado en el 50% secuenciaciones aprox.
Fiable y preciso
 Larga: varias rondas de amplificación, marcaje y
electroforesis
 Cara: 150 bp / 1 $
• Nuevas técnicas de secuenciación:
• SECUENCIACIÓN POR SÍNTESIS
– EXTENSIÓN DE BASES
– LIGACIÓN
• SECUENCIACIÓN MEDIANTE NANOPOROS
• Pirosecuenciación
PPi
ATP
• LIGACIÓN
Detección por fluorescencia:
– LIMITACIÓN:
Requiere muchos emparejamientos simultáneos para
obtener una señal detectable.
SOLUCIÓN
Detección de señales fluorescentes emitidas por una
sola cadena molde (eliminar amplificación)
DE MOMENTO
POLONIAS
Qué son las Polonias??
• Colonias individuales de polimerasa que se forman
sobre un portaobjetos o un gel al someter a una
molécula molde a una reacción de PCR, de forma
que se generan millones de copias del molde en un
soporte físico, que se podrán secuenciar
simultáneamente.
VARIACIÓN:
Producción de polonias en una emulsión lipídica que contiene
polimerasa y actúa como micro cámaras de PCR.
Al añadir bolitas a las que se ha unido el DNA molde se
producirán por PCR millones de copias unidas a la bolita.
Si cada bolita llevaba un molde diferente, al ponerlas en un gel
podremos secuenciar simultáneamente el DNA contenido el cada
una de ellas.
SECUENCIACIÓN POR SÍNTESIS:
 Secuenciación de fragmentos cortos de DNA:
máximo 300 bp. Aprox. (1000 en capilar).
Más difícil ensamblar las piezas.
 Necesitan PCR previa:
caro y se pueden introducir errores.
 454 Life Sciences: prototipo que aumenta la
medida de los fragmentos de 100 a 400 bp.
 Se están desarrollando métodos para poder
secuenciar fragmentos mucho más largos de
ssDNA intentando evitar la PCR.
•SECUENCIACIÓN
MEDIANTE NANOPOROS
• Utilidad actual:
– Detección de cadenas de 150 NTD de un solo
tipo de base.
• Utilidad futura:
– Detección de bases individuales :
Secuenciación del Genoma Humano completo
en 20 h desde cadenas de DNA Reducción de
Tiempo y dinero en copiado de DNA, reacciones
químicas y detectores ópticos.
VENTAJAS DE LAS NUEVAS
TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN:
• Rendimiento:
– Secuenciación por electroforesis: 150 bp / 1 $
– Secuenciación por ligación en bolitas: 1400 bp / 1$
• Automatización:
– Mayor parte del gasto:
• aparatos desde los 90’ el precio se ha reducido a 13 veces
menos del valor inicial.
• reactivos
• Miniaturización:
– Reducción del volumen de reactivos de microlitros a
femtolitros (1000 millones de veces)
RETOS INMEDIATOS:
• Reducción del precio de secuenciación a 1000 $.
• Interpretación del Genoma Humano (SNPs).
Inteligible
UTILIDAD
• COMPARACIÓN DE GENOMAS
• BENEFICIOS MÉDICOS:
– Lista de las variaciones genéticas más importantes
de cada paciente :capacidad de diagnóstico en
individuos con riesgo de ser portadores del gen de
alguna enfermedad.
(4000 genes conocidos causantes de enfermedades
monogénicas. 1000 diagnosticables)
– Desarrollo de nuevas terapias
• Farmacogenómica
• Nuevas estrategias para la terapia génica.
• ESTUDIOS FENOTÍPICOS
• ESTUDIOS GENEALÓGICOS
IMPLICACIONES ÉTICAS
• Límites de la manipulación genética
(terapéutica o para mejorar)
• Necesidad de asegurar la privacidad.
• Posibles malos usos:
–
–
–
–
–
–
–
–
Compañías de seguros
Intereses comerciales
Empresas
Tribunales
Escuelas
Agencias de adopción
Decisiones relativas a la reproducción
Bioterrorismo
…………………etc………………..
PROYECTO GENOMA HUMANO
PERSONALIZADO
• Abordar cuestiones éticas y jurídicas.
• Explorar los pros y contras del genoma
personalizado.
• Genoma de voluntarios a disposición
pública, junto con historia médica y líneas
celulares humanas representantes de
cada individuo.
• proyecto abierto ampliamente accesible.
El Periódico, 2/6/07
El 'descubridor' del ADN
conoce su genoma completo
• El genoma de James Watson es el segundo genoma humano
secuenciado completamente (junto al de Craig Venter).
Ambos estan disponibles en el GenBank.
• 454 Life Sciences.
• Ha costado algo menos de un millón de dólares
• "Pienso que lo normal sería mantener en secreto la información genética
personal, pero he dicho a 454 que puede publicar la mía, aunque indique
algo acerca de la de mis hijos".
• "siempre que no divulguen al mundo que tengo alguna enfermedad de la
que no quiero enterarme".
• La fiebre por obtener el propio genoma se extendió entre los
estadounidenses adinerados y ya hay varios inscriptos, quienes
participarán en el premio " Archon X Prize", que dará 10 millones de
dólares al equipo que logre secuenciar 100 genomas en 10 días.
GRACIAS POR
VUESTRA
ATENCIÓN!!!
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