MESA:4
INTEGRANTES:
•CASTILLO AVILA BERENICE
•CHARGOY CRUZ ARIE GABRIEL
•ESPINOSA CANO RENE MISAEL
•GARCIA ARROYO ALEJA GUADALUPE
•PINEDA MURILLO JONATHAN YAHIR
•ROMERO ESTRADA MARCO ANTONIO
•TORRES MUNGUIA RICARDO
Nuestro propósito es que conozcan las pruebas bioquímicas que se
utilizan en el área de bacteriología y de igual forma conocer sus
características de cada una de ella en cada medio de cultivo según la
prueba.
DEFINICION DE PRUEBAS BIOQUIMICAS
Consisten en distintos test químicos aplicados
a medios biológicos, los cuales, conocida su
reacción, nos permite identificar distintos
microorganismos presentes.
Su sistema de funcionamiento consiste en
determinar la actividad de una vía metabólica
a partir de un sustrato que se incorpora en un
medio de cultivo.
GRAM +
GRAM -
Coagulasa
Ornitina. Movilidad, lisina
Oxidasa
Fermentación de
carbohidratos
Catalasa
Producción de acido
sulfhídrico
Citrato
Urea
Fermentación con producción
de gas
Indol
RM( Rojo de metilo)
VP( Vogas Proskaver)
Objetivo: Permite separar Staphilococcus aureus, que
produce la enzima coagulasa, de las otras especies de
estafilococos que se denominan coagulasa negativos.
Fundamento: Staphilococcus aureus posee dos tipos de
coagulasa:
* Una endocoagulasa o coagulasa ligada que está unida a la
pared celular. Esta actúa directamente sobre el
fibrinógeno provocando la formación de coágulos cuando se
mezcla una suspensión bacteriana con plasma citratado u
oxalatado, la velocidad de coagulación es directamente
proporcional a la concentración enzimática.
Técnica: varía según la coagulasa investigada.
- coagulasa ligada y libre: (en tubo)
colocar volúmenes iguales de plasma citratado y de
cultivo de caldo de staphilococccus (o ansa, una buena
cantidad de colonia pura) mezclar suavemente e incubar
durante 4hs a 37ºC controlando cada 30min, si se
produce la coagulación.
Resultados:
EN TUBO.
Positivo: coagulo total. o parcial, cualquier grado de
coagulación.
Negativo: suspensión homogénea (staphylococcus
epidermidis) u otro organismo.
Fundamento: la enzima catalasa se encuentra en la mayor parte
de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que
contienen citocromo (excepto el streptococcus) generalmente
las bacterias que carecen de citocromo también carecen de
catalasa, lo que les impide descomponer el peróxido de
hidrogeno.
La catalasa descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en
agua y oxígeno bajo la fórmula 2 H2O2-->2 H2O + O2. De esta
manera las bacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2,
que es un producto final del metabolismo aerobio de los
azúcares.
Técnica: Se coloca una gota de H2O2 al 30% sobre
un portaobjetos y luego se transfiere una porción de
colonia sobre el H2O2 realizándose una emulsión. En lo
posible debe tomarse la colonia a partir de un medio sin
sangre ya que los eritrocitos tienen actividad de catalasa
y pueden falsear los resultados.(falso positivo)
Esta prueba también puede realizarse en un aislamiento
en tubo, simplemente colocando unas gotas de H2O2
dentro del mismo.
Resultados:
Positivo: producción de burbujas (por liberación de oxigeno)
Negativo: no se producen burbujas
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La
reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el
oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la
especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de
electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el
sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios,
algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún
microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de
actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la
producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno
que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya
acumulación es tóxica.
La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para:
•Identificar todas las especies de Neisseria (+)
•Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las
enterobacterias.
El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de
diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs).
Realización de la prueba:
1.-Método en placa directa
Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar
toda la placa y no invertirla.
Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se
produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y
McLeod es dentro de los 10-30 minutos.
2.-Método indirecto sobre papel
Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una
placa de Petri.
Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.
La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.
Prueba MIO (Motility-Indole-Ornitine ó Motilidad-Indol-Ornitina)
Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la
reacción de Indol a la descarboxilación de la ornitina.
Procedimiento:
Inocular en picada las cepas de microorganismo en el medio de cultivo e incubar por 24
horas a 37° .
INTERPRETACION Y RESULTADOS:
REACCION
INTERPRETACION
Enturbamiento del agar
Hay movilidad
Agar transparente desarrollo
solo en picada
No hay movilidad
Azul
Descarboxila ornitina
Coloración amarilla (acido)
No descarboxila
Rojo
Indol (+)
Amarillo
Indol (-)
Las pruebas de fermentación de carbohidratos son útiles para
complementar los resultados de las pruebas de utilización de los
hidratos de carbono cuando existe alguna dificultad para la
identificación definitiva de un organismo.
Los medios de fermentación contienen peptona, extracto de
ternera o de levadura, un indicador y fuentes de carbohidratos
individuales. La fermentación se detecta únicamente por la
producción de gas. La producción de ácidos, como indica el cambio
de color del indicador, no es indicio de fermentación.
El medio Hierro y Triple Azúcar permite diferenciar bacilos entéricos
Gram-negativos basándose en su diferente capacidad de fermentación a los
tres azúcares (glucosa, sacarosa y lactosa) y producción de sulfhídrico. La
degradación del azúcar da lugar a la formación de ácido que se detecta por
un cambio de color del rojo de fenol que pasa de anaranjado a amarillo,
mientras que si el medio sufre una alcalinización pasa de anaranjado a
rojo/púrpura. Los microorganismos que sólo fermentan la glucosa, como
Salmonella y Shigella, (que se encuentra en una concentración 10 veces
inferior a los otros azúcares), si bien producen el viraje al amarillo, éste sólo
se mantiene en la columna vertical (base del tubo) mientras que la superficie
inclinada restablece el color rojo por oxidación del ácido. El color amarillo
obtenido en la acidificación del medio producida por la fermentación de la
sacarosa o de la lactosa es persistente. Los cultivos que contienen
microorganismos capaces de formar Hierro(II) Sulfuro presentan el
característico precipitado negro. La producción de gas se observa por la
formación de burbujas e incluso por la rotura del propio gel.
Hierro de Kligler, Agar
Se emplea en la diferenciación de bacilos entéricos Gramnegativos según la fermentación de dos azúcares (glucosa y
lactosa) y la producción de Hidrógeno Sulfuro.
Fundamento
Por este medio se trata de diferenciar los bacilos entéricos
Gram-negativos tanto por su capacidad de fermentar la lactosa
y/o la glucosa como por la de producir Hidrógeno Sulfuro. La
acidificación del medio a causa del proceso fermentativo se
pone de manifiesto con un cambio de color del rojo de fenol que
pasa de rojizo a amarillo. Los microorganismos que sólo
fermentan glucosa, como Salmonella y Shigella, que se
encuentra en una concentración 10 veces inferior a la lactosa,
si bien, producen el viraje al amarillo, éste sólo se mantiene en
la columna vertical (base del tubo) mientras que la superficie
inclinada restablece el color rojo por oxidación del ácido. El
color amarillo obtenido en la acidificación del medio, producida
por la fermentación de la lactosa, es persistente, por lo que la
superficie indicada se mantiene amarilla. Los cultivos que
contienen microorganismos capaces de formar Hierro(II)
Sulfuro presentan el característico precipitado negro. La
producción de gas se observa por la formación de burbujas e
incluso por la rotura del propio gel.
TSI:
El tiosulfato de Sodio es el sustrato necesario para la
producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio,
es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido
sulfhídrico y producen sulfuro de hierro de color negro.
SIM:
La sepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la
turbidez que producen alrededor de la punción de siembra,
mientras que aquellas sepas productoras de ácido sulfhídrico
se distinguen por la formación de un precipitado negro de
sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio
se mantenga a un pH mayor a 7.2.
Kligler:
En el medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteína, aportan
los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa
y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El
tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de
ácido sulfhídrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de
iones Fe 3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico
y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el
indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico. El agar es el agente solidificante.
Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de
utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos
amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo,
provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias
estas características se dan en los siguientes
géneros:Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas
especies de Salmonella. Sin
embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella
paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.
Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este
medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes
de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol
como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el
citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio
lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una
fuerte gasificación del medio que será aparente por un cambio de
color del indicador de pH, de verde a azul.
Resultados
-Positivo: crecimiento y color azul en el
pico, alcalinidad.
-Negativo: el medio permanece de color
verde debido a que no hay desarrollo
bacteriano y no hay cambio de color.
MICROORGANISMO
CITRATO
PERMEASA
COLOR DEL
MEDIO
Klebsiella pneumoniae
Positivo
Azul
S. Typhimurium
Positivo
Azul
E. Coli
Negativo
Verde
S. flexneri
Negativo
Verde
Christensen Medio (Urea AgarBase).
Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la
actividad ureásica.
Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como
Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos.
En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los
nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de
sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo de fenol es el
indicador de pH.
Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa
liberando amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos
alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al
rojo. En este medio, la fermentación de la glucosa activa la enzima
ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos
organismos que hidrolizan lentamente la urea, como especies de
Enterobacter o Klebsiella.
El indol es uno de los productos de degradación metabólica del
aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son
capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de
indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una
característica importante para la identificación de muchas
especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la
formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el
grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio
activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo
utilizado debe ser rico en triptófano.
Procedimiento:
Inocular el caldo triptófano con el organismo en estudio e
incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este
período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared
interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en
la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de
añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba
positiva.
Resultados:
(+) Escherichia coli
( - ) Klebsiella pneumoniae
El Medio MR-VP es utilizado para la diferenciación de organismos coliformes
en base a las pruebas de Rojo de metilo y Voges-.Proskauer. Este medio
también es conocido como Rojo de Metilo Voges- Proskauer.
La prueba para detectar a los altos productores de ácido es conocida como
Rojo de Metilo (MR). La prueba para detectar a los menos productores de
ácido está basada en el procedimiento que describieron Voges y Proskauer en
1898 donde se presenta una reacción colorida cuando los cultivos se incuban
en un medio conteniendo dextrosa y peptona y se les adiciona hidróxido de
potasio exponiéndolos al aire. Esta reacción pone de manifiesto la formación
de acetilmetilcarbinol y es conocida como la prueba de Voges-Proskauer (VP).
En este medio las peptonas proporcionan la fuente de carbono y nitrógeno. La
dextrosa es el carbohidrato fermentable y el fosfato actúa como buffer.
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Diapositiva 1 - labacteriologia