Aislamiento de
Plásmidos
Bioquímica Experimental
Equipo 3
•Cabrera Peralta Andrea
•Fuentes Pineda Rosinda
•Gómez Reynoso Claudia Nathalli
•Ortiz Pastrana Naytzé
¿Que es un plásmido?
• Los plásmidos son moléculas de ADN que
se encuentran en las bacterias, y que son
independientes
del
cromosoma
bacteriano.
• No son vitales para la célula
Sus principales características
son:
• Son pequeños (unos cuantos miles de
pares de bases)
• Suelen llevar sólo uno o unos pocos
genes
• Son circulares
• Tienen un único origen de replicación
• Múltiple número de copias
• Marcadores Seleccionables
Al igual que el DNA cromosomal el
plásmidico puede presentar las siguientes
características:
• Doble hélice
• Estabilizada por
puentes de
hidrógeno
• En la célula
generalmente
superempacada
o superenrollada
Conformaciones de un plásmido
• Linealizado: Es decir cuando se ha cortado
ambas cadenas del DNA sólo una vez.
• Parcialmente linealizado: Cuando se ha
cortado el DNA en una de las cadenas
• DNA relajado circular. DNA que no se ha
empacado.
• Superenrrolado: Covalentemente cerrado y
muy empacado
• Superenrollado desnaturalizado. Parecido al
anterior pero un poco menos empacado
TOPOISOMEROS. Producto del
superenrollamiento plásmido
• Existen varias
conformaciones de los
plásmidos en el estado
superenrollado.
• Por lo que pueden
migrar en un campo
eléctrico de manera
muy diferente cada uno
a pesar de tener el
mismo peso molecular
• Los plásmidos han sido modificados en el
laboratorio
para
su
uso
como
herramientas de ingeniería genética, ya
que son útiles en la expresión de genes
particulares
Estructura plásmido usado en biología
molecular. Vector de clonación
Se compone básicamente de:
• Origen de replicación
• Genes de resistencia a antibióticos
(Marcador de selección)
• Sitio múltiple de clonación
Objetivos
• Realizar el aislamiento de DNA
plasmídico.
• Conocer los fundamentos para la
purificación del DNA plasmídico y su
separación de DNA genómico.
Reactivos
• 5mL de medio Luria-Kanamicina
(30μg/mL)
• Solución GTE: 50mM glucosa, 25mM Tris/HCl pH=8.0 y
EDTA 10mM pH=8.0
• Solución de lisis: 0.2N NaOH y 1% SDS p/v
• 3M Acetato de potasio pH=4.8
• 70% Etanol
• Isopropanol
Fundamento:
Obtención de plásmido mediante la técnica de
LISIS ALCALINA
- Desnaturalización alcalina en presencia del detergente
dodecil sulfato de sodio (SDS)
- Se basa en las diferencias con respecto a la forma y tiempo
de desnaturalización y renaturalización del ADN de plásmido
versus el ADN cromosomal
DNA se puede desnaturalizar
• El calor, pH, la
concentración de iones,
influyen en la estabilidad
de la doble hélice.
• En la desnaturalización
se deshace su estructura
nativa, es decir se
eliminan sus puentes de
hidrógeno.
• Dos hebras separadas
que se pueden volver a
unir.
La re-naturalización
• El DNA se puede
volver a re-naturalizar.
• Hay que hacerlo en
condiciones suaves
para que el apareo de
bases sea el correcto.
• De no ser así se
pueden producir
agregados fácilmente
precipitables.
Proceso de desnaturalización y renaturalización
Paso 1
- Crear un ambiente osmótico hostil para la bacteria para
lograr su lisis y liberar el material genético
- Comenzar por desestabilizar a la membrana bacteriana
- Solución GTE de alta concentración de sales, glucosa y
ácido etilendiamino tetracético (EDTA)
Paso 2
- Solución con una alta concentración de SDS e hidróxido
de sodio.
SDS: Lisar la membrana celular.
NaOH: Desnaturalizar el ADN.
-El ADN cromosomal se desnaturaliza más rápidamente
que el ADN de plásmido (cerrado).
Paso 3
-A la mezcla de ADN desnaturalizado tanto plásmido
como cromosomal se le añade acetato de potasio para
regresar a un pH menos drástico y que se vuelvan a
formar los puentes de hidrógeno.
-Sin embargo, el ADN cromosomal es muy largo y por
tanto no logra establecer bien sus puentes de hidrógeno
y forma un agregado junto con el SDS y las proteínas
bacterianas, el cual precipita.
-Al centrifugar, en el sobrenadante queda el ADN
plasmídico y en el botón el cromosomal
Paso 4
• El ADN del plásmido del sobrenadante se
transfiere a otro tubo y es concentrado por
precipitación con etanol en frío.
• Centrifugar y tirar el sobrenadante
• El botón de DNA plasmídico se puede lavar
nuevamente con etanol o isopropanol.
• Resuspender el botón en agua y almacenar
Atención!
-Es posible que la muestra contenga trazas de
DNAasas bacterianas
-Para evitar la degradación de las moléculas de ADN
por
estas enzimas, se aconseja trabajar de forma rápida y
con soluciones a baja temperatura
Bibliografía
• C. J. Puerta, C. P. Ureña. (2001).
Prácticas de Biología Molecular. Pontificia
Universidad Javeriana. p. 31-35
• J. B. Jenkins. (1985). Genética. Reverté.
Barcelona. p. 575-6
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