Presenta 2 procedimientos basados en su velocidad y su éxito:
• Miniprep de lisis alcalina
• Miniprep por litio
– Almacenamiento de DNA plasmidico
El aislamiento de plásmidos de DNA de células bacterianas es importante para el
análisis de clones.
Muchos protocolos para la elaboración de Minipreps son utilizados.
Los procedimientos presentados permiten la recuperación de plásmido de DNA
circular sobre el DNA cromosómico lineal.
Se presenta dos métodos fiables y más utilizados (lisis alcalina y Minipreps en
litio.
La elección del método esta en función de:
– La experiencia del investigador.
– Por las preferencias personales, así como el tamaño y tipo del plásmido que se
requiera.
• Los tres métodos proporcionan plásmidos de DNA con
rendimiento y calidad adecuada.
• El rendimiento del ADN está determinado más por el tipo de
plásmido que por el método de aislamiento.
• Los tres métodos son eficaces para el aislamiento de pequeños
plásmidos (< 10 kb).
• Es el procedimiento mas comúnmente usado.
• El plásmido es preparado de pequeñas cantidades de muchos
cultivos diferentes de bacterias conteniendo plásmidos.
• Las bacterias son lisadas por un tratamiento con una solución de
SDS y NaOH.
• La mezcla es neutralizada con acetato de potasio, haciendo que el
DNA plasmidico covalente se cierre rápidamente.
• Mas de DNA cromosómico y bacterial precipitan proteínas y son
removidas por centrifugación.
• EL DNA del plásmido removido del sobrenadante se concentra
por la precipitación de etanol.
•
•
•
•
•
•
•
•
Medio LB con antibiótico
Glucosa/ Tris/ EDTA
Buffer TE
Solución de NaOH/SDS
Acetato de potasio
Etanol al 95 y 70%
10mg/ml DNasa-RNasa
Tubos Eppendorfs 1.5 ml
2
1 Inocular 5 ml de medio
con una cola colonia
bacterial (crecimiento
saturado)
5
6
Centrifugar x 3 min los
restos celulares y el DNA
cromosómico
Centrifugar 1.5 ml de
cultivo por 20 s a la
máxima velocidad hasta
formar el pellet.
Transferir el sobrenadante a
otro tubo, mezclar con 0.8 ml
de etanol al 95% y dejar por 2
min a temperatura amb. hasta
pp los ácidos nucleicos
Resuspender el pellet en 100
µl de solución GTE y dejar a
temperatura amb x 5 min
4
Agregar 150 µl de acetato de
potasio y agitar en vortex
por 2 s.
8
7
3
Agregar 200 µl de
NaOH/SDS. Homogenizar
golpeando el tubo con el
dedo. Colocarlo en hielo por
5 min.
9
Centrifugar por 1 min para
que se forme el pellet de DNA
y RNA plasmidico
Quitar el sobrenadante, lavar
el pellet con 1 ml de etanol al
70 % y secar a vacio.
10
Resuspender el pellet en 30
µl TE
• En el Miniprep de lisis alcalina, el tratamiento con SDS y NaOH
rompe las células bacterianas.
• La adición subsiguiente de acetato de potasio realinea
covalentemente el DNA plasmidico cerrado, mientras que el
DNA cromosómico y las proteínas se encuentran atrapados en
un complejo formado entre el potasio y el SDS.
• El aislamiento exitoso dependerá de la cepa.
• Contaminación por DNasa y RNasa, lo cual se evita utilizando
cantidades bajas de la enzima.
• El rendimiento de la lisis alcalina se puede aumentar usando 500
mg/ml de lisozima en el paso 3 del protocolo.
• El plásmido es obtenido de cultivos en sólido o líquido de E. coli.
• Las células son secuencialmente tratadas con Triton X-100/LiCl y
fenol/cloroformo. Se solubiliza el plásmido de DNA mientras que el
DNA Cromosómico se precipita junto con los desechos.
• Los desechos se remueven con centrifugación.
• Esto produce los procedimientos de aislamiento del plásmido de DNA
que son virtualmente desprovistos de DNA cromosómico.
• La ventaja de esta técnica es por ser fiable de rápida.
• La preparación del plásmido tienen una pureza y calidad que pueden
emplearse en la mayoría de sus aplicaciones.
•
•
•
•
Solución TELT
Medio LB con antibiótico
1:1 (w/v) fenol/cloroformo
Etanol al 100% prerefrigerado a 20ºC
• Buffer TE
• *10 mg/ml Dnasa libre de Rnasa A
• Tubos Eppendorf de 1.5ml
13
Se aísla el DNA plasmidico
de colonias en
crecimiento en agar
Con una microespatula,
se toma una colonia de 2
a 5 mm de la caja de con
agar
Colocarla en un tubo de
microcentrifuga conteniendo
100 µl de TELT.
Agitar en el vortex para
homogenizar la colonia en el
TELT.
TODO SE HACE A Tº AMBIENTE.
23
Se aísla el DNA plasmidico
de colonias en cultivo
líquido
Inocular una colonia
bacterial en 1.8 ml de
medio LB con antibiótico.
Incubar con agitación de 18 a
24 horas a 30 º C.
Trasferir cuidadosamente en
un tubo Eppendorf.
Centrifugar a 10,000 rpm
durante 20 s.
Retirar el sobrenadante con
una pipeta Pasteur conectada
una línea de vacio.
TODO SE HACE A Tº AMBIENTE.
Agregar 100 µl de TELT y
agitar en vortex por 5 s.
3
Agregar 100 µl 1:1 de
fenol/cloroformo y agitar
5 s en vortex.
Lavar el pellet con 1 ml de
etanol al 100% frío y mezclar
con el pellet. Repetir los dos
pasos anteriores.
Centrifugar 1 min a 15,000
rpm
Quitar el sobrenadante por
decantación. El tubo debe
quedar casi seco, retirar
restos cuidadosamente con
papel absorbente.
Tapar el tubo. Y abrir un
pequeño agujero . Y colocar
la muestra en un desecador
con vacio hasta que este
completamente seco.
TODO SE HACE A Tº AMBIENTE.
Retirar cuidadosamente 75 µl
de sobrenadante y trasferir
a un tubo nuevo.
Al resto del sobrenadante
agregar 150 µl de etanol al
100% frio, mezclar con el
precipitado del plásmido de
DNA.
Disolver el pellet en 30 µl de
TE. Agitar en vortex . Usar 2
o 5 µl de solución de DNA en
una solución de 20 µl.
• El tratamiento con Triton X-100/LiCl el cual actúa en la
membrana interna.
• Este no tiene ningún efecto sobre la morfología general de las
células, ni tampoco lleva a la liberación de DNA plasmidico de
las células.
• La adición subsiguiente de fenol/cloroformo, conduce a la
desnaturalización y precipitación de las proteínas intracelulares.
• La contracción rápida de las células expulsa el DNA plasmidico en el
medio, sin perder el DNA cromosómico. Las proteínas celulares
desnaturalizadas se quedan con la masa celular.
• La morfología bacteriana, de la dotación de la pared celular, se
mantiene en estas condiciones durante al menos 30 minutos, al punto
que se deriva la lisis celular.
• El DNA cromosómico se retira con los restos celulares por
centrifugación, el ADN plasmidico superenrollado se concentra por
precipitación con etanol.
• Se conserva por periodos cortos (1 mes) en cepas a 4º C.
• El almacenamiento permanente es muy complejo, el plásmido puede hacerse
crecer en presencia de saturación del agente selectivo apropiado.
– En un volumen igual se separa la muestra en viales estériles y se agrega glicerol o
una solución base DMSO y se refrigera a -70ºC
• Los plásmidos de DNA pueden ser almacenados en un TE a 4º C por varias
semanas o presérvalo por varios años por congelación de -20ºC a -70ºC.
Solución de Glucosa / Tris /
EDTA (GTE)
50 mM glucos
25 mM Tris·Cl, pH 8
10 mM EDTA
Esterilizar y guardar a 4ºC
Solución de STET
Sacarosa al 8%
Tritón X-100 al 5%
50 mM EDTA
50 mM Tris·Cl, pH 8
Esterilizar por filtración y
guardar a 4ºC
Solución NaOH / SDS
0.2 N NaOH
1% sulfato dodecil de sodio
Preparas justo a su uso
Solución de Acetato de potasio
5M, pH 4.8
29.5 ml ác. Acético glacial
Pellets KOH a pH 4.8
100 ml H2O
Mantener a Tº Ambiente no
esterilizar
Solución TELT
2.5 M LiCl
50 mM Tris·Cl, pH 8
62.5 mM Na2 EDTA
Tritón X-100 al 4%
Guardar alicuotas con 1-5 ml
a -20ºC, no esterilizar
• Más breve que otros Minipreps de DNA.
• El resultado de calidad obtenido por este método ha sido verificado por el
hecho de que no se encuentran problemas en lo que respecta a la inhibición
de algunas actividades de las enzimas de restricción sensibles.
• Cualquier inhibición de la fragmentación del DNA es probable que sea
debido a la contaminación del DNA con los restos celulares en la fase fenol /
cloroformo.
– esto puede ser fácilmente superado por la reducción del volumen de
DNA en la mezcla de reacción.
Wiley & Sons. 1987. Current Protocols in Molecular Biology.
Wiley & Sons. 1987. Current Protocols in Molecular Biology.
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