Tecnología de ADN
Recombinante
Prof. Javier Cabello Schomburg, MS
Reflexión
• Cada criatura, al nacer, nos trae el mensaje de
que Dios todavía no ha perdido la esperanza
en los hombres.
• Rabindranath Tagore
Árbol Filogenético de la Vida
Dominio Bacteria: Bacterias en sentido estricto o eubacterias (todos unicelulares
procariotas)
Dominio Archaea: Arqueobacterias o arqueas. Son un linaje de procariotas unicelulares
totalmente distintos a las eubacterias.
Dominio Eukarya: Eucariotas (tanto unicelulares como pluricelulares).
¿Qué es un organismo modelo?
• Son una herramienta fundamental en algunas áreas de la
investigación científica, ya que permiten realizar estudios sobre
determinados caracteres y los resultados pueden ser
extrapolados a otras especies
• Las especies que se eligen como modelo tienen las siguientes
características en común:
• Fácil manutención y manipulación en el laboratorio;
- Ciclos de vida cortos;
- Gran número de descendencia;
- Disponibilidad de variabilidad fenotípica y genotípica;
- Fenotipo de interés sencillo de observar o medir;
- Técnicas de estudio puestas a punto para estas especies.
organismos modelo en Genética
Tecnología del ADN
El genoma de un organismo es el juego completo de ADN.
La planificación del Proyecto Genoma Humano se inició en 1986, previsto para el
2007. En Junio de 2000 se presentó el 90% del borrador con la secuenciación de unos
30,000 genes y 3 mil millones de pares de bases (pb). Los genes son secuencias
específicas de bases que codifican instrucciones para hacer proteínas.
Los genes son un 2% del genoma humano.
Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2%
IDENTIDAD GENÉTICA
60%
De 289 genes
humanos
implicados en
enfermedades,
hay 177
cercanamente
similares a los
genes de
Drosophila.
20%
70%
95% idéntico
Humanos
30,000
genes
Chimpancé
30,000
genes
Ratón
30,000
genes
A. thaliana
25,000
genes
C. elegans
19,000
genes
R.
ALE
GRÍ
A
CON
D. melanogaster
ACY
13,000
genes
T
200
Enzimas de Restricción
“Tijeras Moleculares”
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
• En 1968 se purificó la primera endonucleasa de
restricción, la K12 en E coli.
• Cortaba fragmentos largos y concretos, por lo que se
pensó que reconocía secuencias específicas del ADN.
• Se abandonó porque aunque reconocía una zona
determinada del ADN, cortaba al ADN a varias Kb de distancia.
• En 1970 se aísla otra endonucleasa de restricción en
Haemophilus influenzae, que reconoce y una secuencia en
un duplex de ADN y la rompe en ese lugar produciendo
fragmentos discretos de longitud y secuencia bien definidos.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Fenómeno de restricción: reconocimiento por parte de una
bacteria de un ADN extraño y lisis del mismo en pequeños
fragmentos.
El fenómeno de restricción se descubrió en E coli, cuando
se hizo crecer el bacteriófago lambda. Si la bacteria crece
encontraremos varias colonias por placa. Si no crece, no
encontaremos colonias.
En la cepa C de E coli crecía bien el bacteriófago , pero
si este se crecía en la cepa K o la R, la eficiencia de
crecimiento era mucho menor o nula. El fago era restringido
por esta cepa.
MODIFICACION- RESTRICCION
Típico ejemplo de
restricción de crecimiento
del bacteriófago lambda
en una cepa determinada
de E. coli
La eficiencia con la que el fago
crece en una cepa depende de la
última cepa donde fue propagado.
MODIFICACION- RESTRICCION
Explicación:
El DNA del fago es degradado en cuanto se incorpora, y a la
endonucleasa responsable de esta degradación se le llama
endonucleasa de restricción o enzima de restricción.
El huésped restrictivo debe proteger a su propio ADN de la
acción de las enzimas de restricción y para ello modifica
a su propio ADN.
Modificación: metilación de ciertas bases en un número muy
limitado, justo en los lugares de reconocimiento de las
enzimas de restricción.
El DNA del fago que sobrevive algún ciclo en el huésped restrictivo
se replica y también es metilado por las metilasas de la bacteria, y por
tanto modificado y protegido, y puede crecer bien en una nueva
reinfección.
METILACION Y RESTRICCION
SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION
SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION
Nomenclatura:
Tres letras:
1a letra de género de la bacteria donde se encontró
2a y 3a letras especie de la bacteria donde se encontró
Letra de la cepa donde se produce la enzima de restricción (si es alguna
cepa especial)
Si en la misma bacteria hay varios sistemas de restricción, se especifica
por números romanos.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Extremos cohesivos
Extremos romos
ENDONUCLEASAS DE
RESTRICCION
Para reconocer el tamaño de
los fragmentos que se
producen tras la acción de una
endonucleasa de restricción
se utiliza la electroforesis
en gel de agarosa y la
tinción con bromuro de
etidio.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Se han estudiado 10,000 bacterias para
Encontrar enzimas de restricción.
Se han encontrado 3,000 enzimas de
Restricción específicas para aproximada
mente 200 secuencias de ADN.
Las enzimas diferentes que tienen
especificidad por la misma secuencia
de ADN y que cortan en el mismo sitio
se les llama isoschizomeros.
Si reconocen la misma secuencia pero cortan en diferente lugar
al ADN se les denomina neoeschizomeros.
www.rebase.neb.com
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
El número y el tamaño de fragmentos de ADN generados por
una enzima de restricción depende de la frecuencia de aparición
De los lugares diana en el ADN.
Teóricamente, si tenemos un ADN que sea:
- 50% de frecuencia de C+G
- las cuatro bases distribuidas al azar
El número de cortes en sería cada:
si la secuencia diana es de 4 bases corte cada 44(256) bases
si la secuencia diana es de 6 bases corte cada 46 (4096) bases
En la práctica, no ocurre exactamente así.
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
 Son nucleasas que reconocen las moléculas de ADN en sitios
determinados, por medio del reconocimiento de secuencias específicas
 Las secuencias de reconocimiento son palindrómicas
 Tipos de endonucleasas de restricción:
• tipoI y III: cortan el ADN en sitios poco específicos y distantes del
sitio de reconocimiento
• tipo II: cortan las dos hebras de DNA en puntos equivalentes, muy
específicos, dentro de la secuencia de reconocimiento. Son las más
útiles en ingeniería genética.
 EcoRI: efectúa cortes
escalonados en la secuencia
palindrómica específica de 6pb
EcoRI
 EcoRI: genera fragmentos
complementarios de hebra
simple denominados fragmentos
de restricción con extremos
cohesivos
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
 Sitios de restricción: secuencias palindrómicas reconocidas por las
endonucleasas de restricción.
Sitios de corte
EcoRI genera fragmentos de
restricción con extremos cohesivos
Eje de simetría doble
EcoRV genera fragmentos de
restricción con extremos romos
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
 Nomenclatura:
mediante tres
letras tomadas del
género y la especie
de la bacteria de la
que se aislaron
originalmente,
seguida de una
letra que indica el
serotipo y un nº
romano, en el caso
de haber
encontrado
diferentes enzimas
en una misma
variente
 Se han caracterizado más de 3000 enzimas de
restricción de tipo II con más de 200 secuencias
de reconocimiento diferentes.
MAPAS DE RESTRICCIÓN
 Digestión de una molécula de DNA con una enzima de restricción.
 Separación de los fragmentos de restricción mediante electroforesis
Sitios de restricción para EcoRI
B
C
D
E
F
G
NRH
A
MAPAS DE RESTRICCIÓN
 Construcción de un mapa de restricción
 Perfil electroforético de los
fragmento de restricción
 Mapa de restricción del
DNA, resultante de la
información obtenida en
(a)
MAPAS DE RESTRICCIÓN
 Digestión del plásmido pAgK84 con:
• BamHI (A)
• PstI (B)
• HaeIII (D)
• HincII (E)
• SacI (F)
• XbaI (G)
• HpaI (H)
• Carril
fragmentos
DNA de tamaño
 Aplicación
deI:los
mapas de de
restricción:
conocido
polimorfismos
de longitud de los fragmentos
de restricción (RFLP), valiosos para el
diagnóstico de enfermedades hereditarias.
NRH
• BglII (C)
MAPAS DE RESTRICCIÓN
 Aplicación de los mapas de restricción: polimorfismos de longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP), valiosos para el diagnóstico de
enfermedades hereditarias.
Vectores de clonación
 Los vectores de clonación son moléculas pequeñas de DNA que se replican
de manera autónoma
 Tipos de vectores
• Plásmidos
 moléculas de DNA circular que se encuentran en bacterias o
levaduras
 se pueden clonar fragmentos de DNA de no más de 10 kpb
• Bacteriófagos
 fagos que infectan bacterias
 se pueden clonar fragmentos de DNA de hasta 16 kpb
• Cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y de levaduras (YAC)
 se pueden clonar fragmentos de DNA de hasta varios cientos de
kpb
Vectores de clonación
 PLÁSMIDOS
Componentes básicos de un vector de clonación plasmídico
ori (origen de replicación)
HindIII
PstI
SalI
BamHI
SmaI
SacI
EcoRI
ampr (marcador de selección)
Policonector
(“polylinker”)
Región donde
se puede
insertar el
DNA extraño
Vectores de clonación
 PLÁSMIDOS
Estructura y componentes del plásmido pUC18 (plásmido de clonación universal)
 Policonector:
contiene 13 sitios de
restricción únicos
 3 genes: permiten la selección de clones
recombinantes
ampR: resistencia a la ampicilina
LacZ: b-galactosidasa
Vectores de clonación
 BACTERIÓFAGO 
No necesaria para la
infección lítica
enzima de
restricción y
separación de los
fragmentos
Fago  infectivo
con un
fragmento
extraño de DNA
Empaquetamien
to in vitro
Apareamient
o y unión
El DNA  remanente contiene
los genes necesarios para la
infección pero es pequeño
Fragmento de DNA
para el empaquetamiento
extraño de 15 kpb
DNA
recombinante
Transformación y selección
Vector recombinante
Cromosoma
de E. Coli
Transformación de bacterias
Replicación del plásmido
Multiplicación celular
 Las bacterias se crecen sobre
placas que contienen agar y
ampicilina (antibiótico).
 Sobreviven las células
transformadas, por poseer
el gen AmpR, el resto
mueren.
Transformación y selección
 Selección de clones que han incorporado un vector recombinante
X-gal: análogo de la lactosa
 Las células que incorporan un vector no recombinante (pUC18 no modificado)
son azules
Biblioteca de ADN
Biblioteca genómica colección de clones formados a partir de todos los fragmentos
de ADN del genoma de una especie, tejido o tipo celular.
Biblioteca de ADN genómico los fragmentos de ADN provienen de la escisión
del genoma. Contiene regiones codificantes y no codificantes. Se genera por
clonación de fragmentos genómicos al azar.
Biblioteca de cADN los fragmentos provienen de los mARNs retrotranscritos.
Contiene sólo las secuencias expresadas de un tipo particular de célula.
TÉCNICAS DEL ADN
RECOMBINANTE
TÉCNICA
PROPÓSITO
Enzimas de Restricción
Cortan ADN en puntos específicos, hacen fragmentos de ADN
ADN Ligasa
Une fragmentos de ADN
Vectores
Virus o fagos: llevan ADN a las células y aseguran replicación
Plasmidos
Clase común de vector
Marcadores Genéticos
Identifican a las células que han sido transformadas
PCR
Amplifica la cantidad de ADN de muestras pequeñas
ADNc
Hace una copia de ADN de ARN mensajero
Sondas de ADN
Para identificar y marcar una pieza de ADN conteniendo cierta
secuencia
Síntesis Génica
Para hacer un gen de una base de datos
Gel Electroforésis
Para separar fragmentos de ADN
Secuenciación de ADN
Para leer la secuencia de bases de un segmento de ADN
mARNs
ADN
Construcción de
Bibliotecas de cADN
mRNAs
Construcción de
Bibliotecas de cADN
Hibridación
Cebador oligodT
Retrotranscripción de mRNAs a cDNA
Eliminación del RNA (con álcali)
Adición de una cola de polidG
oligodC
Síntesis hebra complementaria
Metilación DNA
cDNA
NRH
RT
cDNA
Construcción de
Bibliotecas de cADN
Ligador EcoRI
Región reemplazable
EcoRI
Ligación
Empaquetamiento “in vitro”
EcoRI
Vector: bacteriófago
Viriones 
recombinantes
Infección de E. Coli
Clones 
individuales
Cribado de la genoteca
1) Las colonias se transfieren desde una placa de cultivo a un filtro de
nitrocelulosa
2) Tratamiento del filtro con álcali y posterior secado; el DNA desnaturalizado
queda unido al filtro
3) Apareamiento con una sonda marcada radiactivamente; formación de
híbridos con su DNA complementario
4) Autorradiografía
1
2
3
4
NRH
 Hibridación de colonias “in situ”
Colonias
detectadas
por la sonda
SOUTHERN BLOT
 Permite identificar un fragmento de DNA individual mediante
hidridación con una sonda marcada
DNA
electroforesis
gel
Escisión con
enzimas de
restricción
membrana
Papel de filtro
autorradiografía
membrana
gel
Disolución alcalina
Transferencia del DNA, por
capilaridad, del gel a la
membrana; el medio alcalino
desnaturaliza el DNA.
hidridación
con la sonda
marcada
revelado
NORTHERN
 Permite analizar la expresión de un mRNA determinado
NT
48 h
96 h
Etapas:
• Aislamiento del RNA
• Separación mediante
electroforesis
• Transferencia del RNA a una
membrana de nitrocelulosa
• Hibridación con una sonda
marcada, complementaria al gen
buscado
• Autorradiografía
Ej.: Expresión del mRNA de b-globina en células
diferenciadas de eritroleucemia
NT: células no diferenciadas
48h: células diferencias durante 48h
96h: células diferencias durante 96h
La intensidad de la banda es
proporcional a la cantidad de
mRNA expresada
PCR
 PCR: reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction)
 Permite amplificar regiones de DNA de secuencias conocidas
cebador
cebador
Etapas:
•
Desnaturalización del DNA: 95ºC
•
Hibridación con un exceso de cebadores: 50- 60ºC
Cebador: oligonucleótido de 18-20 nt de longitud
Tienen secuencia complementaria a los extremos 3’ del segmento de DNA de interés
3) Síntesis de DNA: 72 ºC
Taq polimerasa (Thermus aquaticus, bacteria de aguas termales)
Estas etapas se repiten entre 20 a 30 veces
PCR
Ciclo 1
Desnaturalización
Hidridación
Ciclo 3
Desnaturalización
Hidridación
Síntesis
Ciclo 2
Desnaturalización
Hidridación
Síntesis
Síntesis
Ciclos 4, 5, 6, etc…
La secuencia deseada (delimitada por los cebadores) se
incrementa exponencialmente, alrededor de un millón de veces
después de 20 ciclos; el resto de secuencias en la muestra de
DNA original permanece sin amplificar.
CLONACIÓN
 CLONACIÓN: obtención de un clon
TÉCNICAS DE CLONACIÓN
CLONACIÓN de vectores recombinantes
 Se genera un fragmento de DNA de tamaño adecuado (con una enzima de
restricción, por PCR o por síntesis química)
 El fragmento se incorpora dentro de otra molécula de DNA conocida
como vector, que tiene las secuencias necesarias para dirigir la replicación
del DNA
Apareamiento de
Vector de
clonación
DNA extraño
Endonucleasa de
restricción
fragmentos de DNA
extraño con el
vector de clonación
y ligamiento
DNA
recombinante
 El vector, con el DNA de interés, denominado DNA quimérico o
recombinante, se introduce en células huésped donde se replica.
Transformación
 Las células que contienen el DNA buscado se identifican. Selección
TÉCNICAS DE CLONACIÓN
 Ligación: unión de fragmentos de restricción por una DNA ligasa
DNA vector
DNA genómico
fragmentos de
(b) y (c) restricción no
apareados
2 ATP
DNA ligasa T4
2 AMP + 2 PPi
DNA recombinante
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