CARACTERÍSTICAS PARA LA
IDENTIFICACIÓN MICROBIANA
Se
entiende
por
identificación
microbiana al conjunto de técnicas y
procedimientos que se aplican para
establecer la identidad de un
µorganismo.
.
Estas técnicas se utilizan en diferentes
áreas:
En el área clínica es importante conocer cual es el agente
causal de la infección que presenta un enfermo para
poder tratarlo.
Investigación básica donde se aisla un determinado
µorganismo que debe identificarse para comprobar si
se trata de un µorganismo conocido o de uno nuevo
para poder clasificarlo.
En la industria de alimentos, donde las normas de control
de calidad exige que la fabricación de estos alimentos
debe realizarse en áreas controladas con ausencia de
ciertos µorganismos, los alimentos son sometidos a
una serie de controles microbiológicos para asegurar la
ausencia
de
µorganismos
que
puedan
causar
infecciones y/o descartar la presencia de toxinas
capaces de causar intoxicaciones alimentarias.
Los método más utilizados para la identificación microbiana se
clasifican en:
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Métodos
Métodos
Métodos
Métodos
Métodos
basados
basados
basados
basados
basados
en
en
en
en
en
criterios morfológicos.
tinción diferencial.
pruebas bioquímicas.
pruebas serológicas.
detección molecular.
No todos los µorganismos se identifican por las mismas técnicas,
ni con base a un solo método, sino a la combinación de uno
o más.
MÉTODOS BASADOS EN CRITERIOS MORFOLÓGICOS.
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Los rasgos morfológicos (estructurales) han ayudado a los
taxonomistas a clasificar organismos.
Bajo el microscopio pueden
ser tan parecidos
dificultándose su clasificación, aún cuando la morfología
celular dice poco sobre las relaciones filogenéticas, sigue
siendo útil para la identificación bacteriana.
Características macroscópicas, en función del tamaño,
altura de la colonia, forma, color, olor, textura y grado de
adherencia al medio de cultivo.
Por ejemplo: la presencia de endosporas y su localización
resulta de mucha utilidad para la identificación de bacilos
esporulados.
MÉTODOS BASADOS EN TINCIÓN DIFERENCIAL.
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Es posible sacar conclusiones en relación con la morfología
examinando una lamina que fue sometida a un proceso de
tinción.
Estos criterios morfológicos encabezan la primera etapa del
proceso de identificación la mayor parte de la bacterias teñidas
con Gram se pueden clasificar como Gram positivas y Gram
negativas.
Tinciones fluorescentes (naranja de acridina, rodamina, blanco
calcofluor) tinción de inmunofluorescencia directa o indirecta.
Tinciones vitales.
protozoos.
para
la
visualización
Tinciones acidorresistentes y
capsulas, flagelos, esporas…
otras
de
tinciones
espiroquetas
para
y
detectar
MÉTODOS BASADOS EN PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el
µorganismo es capaz de fermentar azúcares, la
presencia
de
enzimas,
la
degradación
de
compuestos,
la
producción
de
compuestos
coloreados.
Aun bacterias fuertemente relacionadas pueden
separase en dos especies diferentes con base a
pruebas bioquímicas.
Por ejemplo las bacterias entericas Gram – forman un grupo
grande y heterogéneo.
Esta familia Enterobacteriaceae incluye a varios patógenos
que causan sindromes diarreicos.
Los géneros clinicamente más importantes son: Escherichia,
Salmonella, Shigella, Citrobacter y Enterobacter.
El género Escherichia, Enterobacter y Citrobacter, fermentan
la lactosa con producción de ácido y gas a diferencia de los
géneros Salmonella y Shigella que no fermentan la lactosa.
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Demostración de la producción de Indol
Aquí se empleó dos tubos con triptona y se inoculó los
microorganismos Salmonella y Staphylococcus Aureus y se dejó
incubado a 37 ºC por 24 horas y después a temperatura ambiente por
7 días.
El tubo de S. Aureus dio positivo con color a rojo cereza, esto indica
que este tipo de microorganismo es capaz de degradar al aminoácido
tritófano formando un producto de hidrólisis de Indol.
Bioquímicamente la Salmonella se caracteriza por no fermentar la
lactosa y por no licuar la gelatina y por no producir Indol, aunque
existen algunas excepciones.
No todos los microorganismos pueden realizar este rompimiento de
triptona a indol, por lo cual esta reacción es de valor taxonómico.
E. coli logró degradar la triptona y reaccionar para producir Indol, es
decir dio positiva la prueba, el microorganismo Gram - a pesar de que
se le consideraba susceptible, en este medio reaccionan sin ningún
problema.

Los sistemas comerciales más comúnmente usados son :
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* BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson). Es un sistema para usar en la
identificación de Enterobacterias, definida como bastones Gram -, aerobios o
anaerobios facultativos, oxidasa (-). Consiste en un tubo de plástico con 12
medios de cultivo contenidos en compartimentos individuales que se
inoculan simultáneamente en una etapa y permiten la detección de 15
características bioquímicas.

* OXI/FERM TUBE II, (Becton Dickinson). Es un sistema listo para usar para la
identificación de bastones gram (-), aerobios o anaerobios facultativos,
oxidasa (+). Consiste en un tubo de plástico de 12 medios de cultivo que
permite la realización simultánea de 14 pruebas bioquímicas.

* API 20 E. Es un sistema estandarizado para la identificación de Bacterias
Gram -. Consiste en una plantilla con microtubos conteniendo medios de
cultivo deshidratados que se reconstituyen al agregar una suspensión
bacteriana. Permite la realización de 23 pruebas bioquímicas a partir de una
única colonia bacteriana
.
Producción Alcohólica de Levadura

En la levadura que realiza una fermentación alcohólica,
como es el caso de cepas en tubo de ensayo “pasteurizado”
produjo mayor fermentación ya que al someterlo al calor se
inhibe el crecimiento bacteriano que no son de nuestro
interés y al inocular levadura esta se desarrolla sin ninguna
dificultad;
lo que ocurrió en el tubo rotulado, no pasteurizado ya que
aunque crecieran levaduras y la fermentación no fue
completa, ya que parte de la glucosa allí existente fue
consumida por los demás microorganismos.
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Producción de H2S por los microorganismos
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Aquí se inoculó los microorganismos E. coli y Salmonella
en un tubo de ensayo cada uno con agar inclinado.
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En el primer tubo con E. Coli no cambio color, dio
negativo, no reacciono con el azufre o no es capaz de producir
ácido sulfhídrico en un medio de aminoácido que contenga
azufre, el microorganismos no se desarrolla en medio de O2 en
este caso.
Mientras que la salmonella si desarrolló (en este medio
con aminoácido) (H2S), esta prueba dio positivo.
También hubo presencia del gas en medio del agar, este
gas demuestra la presencia de (H2S). También el
ennegrecimiento en la línea de siembra, nos indica que hubo
producción de ácido sulfhídrico
MÉTODOS BASADOS EN DETECCIÓN MOLECULAR
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A través de procedimientos y reactivos,
se
pueden
detectar
determinadas
secuencias de ADN que son propias de un
determinado agente microbiano.
PCR se aplica generalmente para la
identificación de µorganismos que no
pueden ser cultivados
por métodos
convencionales
1.
Separación de las cadenas de ADN, ello se realiza
aumentando la temperatura, la cual rompe los enlaces
de H que mantiene unidos a las cadenas de ADN.
2.
Adición de cadenas cortas de polinucleótidos,
denominados
cebadores
que
se
unen
por
complementariedad de bases a cada una de las cadenas
del fragmento de ADN que se desea amplificar, uno se
une a la cadena 5’-3’ y otro a la cadena 3’-5’.
3. Disminución de la temperatura para permitir que los
cebadores hibridicen con las cadenas de ADN de la
muestra problema por complementariedad de bases.
4. Adición del ADN polimerasa, los cuatro nucleótidos y
cofactores, para que tenga lugar la síntesis de la
cadena complementaria.
ejemplos
 Bacterias Vibrio cholerae, helicobacter pylori,
Staphylococcus aureus. Shigella dysenteriae,
Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis.
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
Virus: Parvovirus, Rotavirus, Adenovirus
Rhinovirus.
Protozoarios: Toxoplasma gondii, entamoeba
histolyticum, Tripanosoma cruzi.
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Otro
método
se
fundamenta
en
la
complementariedad de bases de ácidos
nucleicos.
Son aquellos que utilizan sondas de ADN, que
se define como secuencias de oligonucleotidos
de ADN marcados, con un elemento radioactivo
(32P, 125I, 35S)con una proteína unida a una
enzima como la fosfatasa alcalina. Estas sondas
se utilizan para la detección de una secuencia
complementaria de ADN o ARN, presente en el
agente que se desea identificar.
MÉTODOS BASADOS EN PRUEBAS SEROLÓGICAS.
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Implican la utilización de preparaciones de
inmunoglobulinas específicas provenientes de
suero o de un reactivo y que pueden ser de gran
utilidad en la identificación microbiana en
muestras puras o muestras biológicas.
Cada uno tiene un fundamento particular, pero en
líneas generales todos se basan en la reacción de
un antígeno presente en el agente microbiano con
su anticuerpo correspondiente.
Los serotipos permiten diferenciar organismos a
nivel de subespecie, algo de gran importancia en
epidemiología.
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
.
Inmunofluorescencia puede utilizarse para la identificación
del µorganismo aislado o presente en una muestra
biológica.
En el método directo se fija la muestra problema a una
lamina y se pone en contacto con el antisuero específico
marcado con una sustancia fluorescente (rodamina o
fluoresceína) transcurrido el tiempo para que tenga lugar la
reacción antígeno anticuerpo se expone la lamina a la
radiación ultravioleta para visualizar la reacción
ELISA
 Enzyme Linked Immuno Sorbent Asssay" por sus
siglas en inglés que significan Ensayo Inmuno
Enzimático Absorbente. Estudio inmunológico de
laboratorio por medio de reactivos para detectar
diversos gérmenes, tales como virus o protozoarios.

Se basa en la detección de un antígeno inmovilizado
sobre una fase sólida mediante anticuerpos que
directa o indirectamente producen una reacción cuyo
producto, por ejemplo un colorante, puede ser
medido espectofotométricamente
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Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes :
Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa
alcalina,...). El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno.
Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. se realiza con facilidad a la
superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.
Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a
la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo)
o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado
(ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse
unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del
anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se
ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno
marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.
Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las
moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato
enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante
espectrofotometría.
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Esta
prueba
se
utiliza
ampliamente
laboratorios clínicos y le permite al médico:
en
los
Analizar la sangre del paciente con un antígeno (ej., virus
o bacterias) para ver si su sistema inmunológico lo
reconoce como algo que ha visto antes.
Analizar la sangre del paciente para ver si una sustancia
particular como una hormona (un antígeno) está presente
en su organismo.
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