IDENTIFICACIÓN Y MEDICIÓN
DE LA RESPUESTA INMUNE
RESPUESTA INMUNE HUMORAL
SEROLOGÍA
suero
estudio
“Ciencia de la detección de anticuerpos”
Medición de las interacciones Ag - Ac, con fines
diagnósticos, a partir del suero de un animal.
Sensibilidad
Capacidad de una prueba para detectar animales “enfermos”
(VERDADEROS POSITIVOS) en una población “enferma”.
Ejs. BPA-ELISA-WESTERN BLOTTING-INMUNOFLUORESCENCIA
Especificidad
Capacidad de una prueba para detectar animales “sanos”
(VERDADEROS NEGATIVOS) en una población “sana”.
Ejs. IDGA- WESTERN BLOTTING
Prueba
Animal
ENFERMO
SANO
+
Positivo
verdadero
Falso positivo
-
Falso negativo
Negativo
verdadero
CLASIFICACIÓN DE PRUEBAS PARA MEDIR LA RESPUESTA INMUNE
HUMORAL
1. PRIMARIAS
Miden la cantidad de complejo Ag-Ac formado
2. SECUNDARIAS
Miden las consecuencias de la unión Ag-Ac in
vitro
3. TERCIARIAS
Miden las consecuencias o el efecto
protector de anticuerpos en el animal (in
vivo)
Evolución de los anticuerpos contra Brucella abortus
1800
1600
Ig M
1400
1200
Post-infección
Natural
1000
800
Ig G
600
400
200
0
0
30
Post- Vacunación
B. abortus cepa 19
60
90
0
12
0
15
0
18
0
21
1800
1600
1400
1200
1000
0
24
0
27
0
30
0
33
0
36
Ig M
800
600
400
200
0
Ig G
0
15
30
45
60
75
90
5
10
0
12
5
13
0
15
5
16
0
18
Respuesta inmune humoral
Brucella abortus
Isotipo
Cantidad
Presencia
Características
IgM
IgG1
IgG2
IgA
Abundante
Abundante
Escasa
Abundante
Temporaria
Continua
Discontinua
Discontinua
Inespecífica ?
Específica
Específica
Específica
APLICACIONES EN R. A.
BRUCELOSIS BOVINA
Resolución 438/2006 del SENASA.
Prueba
TAMIZ
COMPLEMENTARIAS
BPA – ELISA I
SAT + 2-ME – FPA
ELISA C
DEFINITORIA
VIGILANCIA
EPIDEMIOLÓGICA
FC
PAL - ELISA I
PRUEBAS INMUNOENZIMÁTICAS
ELISA
Fundamento: visualización de la cantidad de Ag-Ac formado a
través de marcadores ligados a enzimas, que en presencia del
sustrato específico, producen una reacción colorimétrica.
ENZIMAS UTILIZADAS
SUSTRATO
• PEROXIDASA
• ortofenildiamina
• Fosfatasa alcalina
• paranitrofenilfosfato
ELISA
Tipos de pruebas
INDIRECTA
SANDWICH
detección de
ANTICUERPO
detección de
ANTÍGENO
COMPETICIÓN
detección de
ANTICUERPO
ELISA INDIRECTO
Lavado
ANTÍGENO
adsorbido
(reactivo)
Lavado
Suero
PROBLEMA
Lavado
ANTIGLOBULINA
marcada con
ENZIMA (reactivo)
Detección de ANTICUERPOS
SUSTRATO de la
enzima (reactivo)
CAMBIO DE COLOR
ELISA COMPETICIÓN
COLOR
Lavado
Lavado
Ac
monoclonal
Conj. con
enzima
peroxidasa
Y
P
O
S
I
T
I
V
O
Suero
Problema
Lavado
Y
Antígeno
Lavado
Y
Lavado
Lavado
Lavado
Sustrato
cromógeno
Y
N
E
G
A
T
I
V
O
Lavado
AUSENCIA DE COLOR
ELISA
VENTAJAS
DESVENTAJAS
 Alta sensibilidad y especificidad
 Rápido
 Reactivos estables
 Resultado visual
 Costo microplacas
 Costo equipo automatización
APLICACIONES EN VETERINARIA
 Brucelosis
Bia
 Babesia
 IBR
Leucemia felina
 Trichinella
 BVD
Salmonella
 Toxoplasma
 Peste porcina
Aftosa
 Toxocara
 Aujesky
Estreptococos
 Hormonas
 Newcastle
TBC
 Micotoxinas
 Cuantificación de
inmunoglobulinas
PRUEBAS SECUNDARIAS
La prueba a realizar depende de las
características del Ag
 SOLUBLE
 PARTICULADO
PRECIPITACIÓN
AGLUTINACIÓN
 SUPERFICIE + COMPLEMENTO
FIJACIÓN DE
COMPLEMENTO
Comparación precipitación - aglutinación
Antígeno
SOLUBLE
Antígeno
PARTICULADO
Anticuerpo
Formación de “retículo”
PRECIPITACIÓN
“Amontonamiento”
AGLUTINACIÓN
AGLUTINACIÓN
Fundamento: un antígeno particulado (ejemplo:
bacterias, eritrocitos), al ser puesto en contacto con su
anticuerpo específico en proporciones óptimas, se une
por medio de enlaces cruzados. Este complejo de unión
agruma, produciendo una reacción de aglutinación.
FENÓMENO DE ZONA O PROZONA
Se produce cuando existe un marcado exceso de Ac con
respecto a los determinantes antigénicos de la partícula, de
tal manera que es poco probable que los dos sitios de unión
de la Ig puedan unirse a dos determinantes antigénicos de
dos partículas distintas, inhibiéndose de este modo la
aglutinación. Generalmente ocurre en las diluciones bajas de
sueros muy positivos.
Antígeno
particulado
(reactivo)
Y
YY
+ YY Y
Proporción
Y
AGLUTINACIÓN
Suero problema
Medio
AGLUTINACIÓN
En PLACA
En TUBO
Salmonella Brucella Micoplasma
Brucella
BPA
SAT+2-ME
PAL
Aglutinación en placa: BPA
Prueba del Antígeno Brucélico Acidificado
1. Suero problema
Aglutinoscopio + placa de
vidrio
2. Antígeno específico
(reactivo)
8 MINUTOS
3. Mezclar
LECTURA E
INTERPRETACIÓN
Con GRUMOS
AGLUTINACIÓN POSITIVA
Sin GRUMOS
Negativa
Aglutinación en tubo: SAT + 2-ME
SAT (Seroaglutinación en Tubo)
Ig M
2- ME (2- Mercaptoetanol)
Ig G
Se realizan en
simultáneo
En TUBO: SAT + 2- ME
2. Solución fisiológica fenicada (SFF)
1. Suero problema
3. Antígeno
60 MINUTOS
SUERO
BPA (+)
SAT
1/25
2. Solución 2-ME
1/50
1/100
1/200
Título
37ºC-48 hs
2-ME
LECTURA e INTERPRETACIÓN
37ºC-48 hs
POSITIVA
INCOMPLETA
NEGATIVA
FIJACIÓN DE COMPLEMENTO
Fundamento: la activación (“fijación”) del complemento
por el anticuerpo unido al antígeno hace que se generen
complejos de ataque de membrana. Si el anticuerpo se
une a eritrocitos, éstos se destruyen y sobreviene
hemólisis.
FIJACIÓN DE COMPLEMENTO
2 sistemas
Sistema de PRUEBA
• Suero problema
Sistema INDICADOR
• Eritrocitos
• Antígeno específico
• Complemento
• Hemolisina (Ac. anti eritrocitos)
FIJACIÓN DE COMPLEMENTO
Eritrocitos
Antígeno
Y YY
C
Suero problema
Complemento
Y
SIN
HEMÓLISIS
POSITIVO
Ac antieritrocitos
Con
HEMÓLISIS
Suero problema
C
Y
Negativo
APLICACIONES EN VETERINARIA
BRUCELOSIS
 IBR
 DVB
 AFTOSA
 MOQUILLO CANINO
 TOXOPLASMOSIS
POLARIZACIÓN FLUORESCENTE
(FPA)
Fundamento:
Se produce in vitro una reacción antígeno-anticuerpo,
enfrentando el suero de un animal enfermo de
brucelosis con una fracción de del antígeno de
bruecella (cadena O), este complejo forma una masa
grande que en suspensión gira mas lentamente .
Además ese antígeno se conjuga con isotiocianato de
fluoresceína (IFTC) y se hacen incidir distintos haces
de luz. El complejo emitirá luz con distintos grados
de despolarización en función de su velocidad de
rotación.

Aglutinación en tubo: PAL
PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE
Fundamento: si en una muestra de leche se encuentra
un anticuerpo específico, y se le agrega un antígeno
particulado coloreado, ambos se unirán, formando un
complejo Ag-Ac que se adhiere a los glóbulos de grasa y
asciende con la nata
PAL
2. Antígeno (reactivo)
1. Leche problema
LECTURA e INTERPRETACIÓN
37ºC-1 hora
+
++
+++
++++
PRUEBAS MOLECULARES
REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA
HIBRIDOMA
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR)
Multiplicación de una secuencia de ADN
específica y conservada de la especie a
identificar, que puede ser visualizada y
cuantificada
NUCLÉOTIDO
Base nitrogenada
Fosfato
Azúcar
ADN
AZÚCAR
FOSFATO
CADENA DE AZÚCAR
Y FOSFATO
BASE

ADN
 OLIGONUCLEÓTIDOS (PRIMERS)
 NUCLEÓTIDOS
 POLIMERASA
A
T
G
C
Polimerasa
Primers
Primers
Polimerasa
ADN
100
Desnaturalización
94º C
90
1 min
Primers
80
70
Extensión
72º C
1 min
35 ciclos
60
Hibridación
50
56º C
1 min
40
Polimerasa
30
dNTP
20
Detección
Producto de PCR para identificar Brucella spp en
muestras de leche
Producto de PCR para caracterizar cepas de
Brucella abortus en muestras de leche
n=223
ID
11
17
33
58
61
113
168
172
189
242
255
1487
151
157
179
228
260
1380
124
PCR
Cultivo
FC
ELISA-C
B. abortus silv.
+
+
B. abortus silv.
+
+
B. abortus silv.
+
+
B. abortus silv.
+
+
B. abortus silv.
+
+
B. abortus silv.
+
+
B. abortus silv.
+
+
37B.%abortus
con B.silv.
abortus silvestre
se +infectó con RB51
+
0,8B.%abortus
de lassilv.
sanas se infectó
con+B. abortus +RB51
(p<0,0001)
B. abortus silv.
+
+
B. abortus silv.
+
+
B. abortus silv.
+
+
+
+
B. abortus silv – RB51
+
+
+
B. abortus silv – RB51
+
+
B. abortus silv – RB51
+
+
B. abortus silv – RB51
+
+
B. abortus silv – RB51
+
+
B. abortus silv – RB51
B. abortus RB51
ELISA-I
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Tipos de
PCR

CON PRIMERS ANIDADOS

ASIMÉTRICA

INVERSA

MULTIPLEX

NESTED
VENTAJAS

FIDELIDAD

SENSIBILIDAD

ESPECIFICIDAD

AUTOMATIZACIÓN
APLICACIONES

Diagnóstico (virales- bacterianas- parasitarias- micóticas)

Enfermedades hereditarias

Enfermedades autoinmunes

OncologÍa

Medicina forense

Arqueología
HIBRIDOMA
Selección
in vitro
en el medio
HAT
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