Hierro-Sodio-Ácido
Áscórbico
Método Absorción Atómica Fe y Na
Valoración oxidimétrica Vit C
Validación de un método analítico.








Una vez desarrollado un método analítico, al igual que toda técnica analítica
deberá validarse, es decir, se debe confirmar y documentar que los resultados
producidos por el método son confiables.
En general, para validar existen 3 tipos de validación:
-Validación Prospectiva: es aquella validación realizada a métodos analíticos
nuevos.
-Validación Retrospectiva: Para métodos analíticos antiguos, pero que se usan en
forma rutinaria, y que no han sido validados.
-Revalidación: repetición parcial o total de una validación debido a cambios
efectuados, que puedan afectar a la capacidad del método validado. (1)
La validación se puede realizar mediante estudios intralaboratorio o interlaboratorios.
-Estudios Intralaboratorio: este tipo de validación lo realiza un laboratorio
individualmente, utilizando materiales de referencia, comparación con otro método,
utilizando muestras blanco o muestras positivas fortificadas, etc.
-Estudios interlaboratorios: conjunto de mediciones a un nivel o varios niveles de
concentración del analito problema, ejecutadas independientemente, por varios
laboratorios, sobre muestras de un material dado. (11)
Validación
 Al momento de validar un método analítico se
requiere actuar mediante procedimientos correctos
entre los que se incluyen; una buena organización
funcional; personal adecuadamente adiestrado en la
aplicación del método; instalaciones adecuadas y
suficientes; equipos, reactivos y material de
laboratorio apropiado y en perfectas condiciones para
su uso; métodos escritos, actualizados y aprobados.
De esta forma se puede garantizar la calidad de los
resultados obtenidos en el laboratorio.
Parámetros Fundamentales de
Validación.

Una vez que se ha realizado el ajuste de los parámetros y se
ha probado con éxito el método en muestras, se está en
condiciones de realizar la validación del método, para poder
confirmar y documentar que los resultados obtenidos por el método
son seguros y confiables

En el proceso de validación, los parámetros que generalmente
son evaluados son:
-Selectividad
-Linealidad
-Precisión
-Exactitud
-Sensibilidad





Validación
 Selectividad ()
 La selectividad de un sistema depende
de la interacción de todos los
componentes, Longitud de onda,
interferentes, etc y muestra.
Selectividad o especificidad.

La selectividad o especificidad de un método
analítico se refiere a la capacidad de un método de
producir una señal medible debida sólo a la presencia
del analito, libre de interferencias de otros componentes
en la matriz de muestra, estas interferencias pueden ser
productos de degradación, metabolitos del mismo
analito en un fluido biológico, etc.

La selectividad se puede controlar simplemente por
la adición, por ejemplo del doble de estándar puro,
verificando el aumento de su señal.
Linealidad.

La linealidad de un método analítico se refiere a la capacidad de un
método de obtener resultados linealmente proporcionales entre la
concentración de analito y su respuesta. Este parámetro se considera como
un criterio inicial de validación, y es necesario verificarlo si se va a trabajar
con un sólo estándar en las determinaciones de rutina. Al trabajar con
estándares múltiples se puede aceptar métodos no lineales,.
 Junto con establecer la linealidad del método se puede estimar el rango de
linealidad del método, es decir, el intervalo de concentraciones para el cual
el método ha demostrado responder en forma lineal y dentro del cual se
puede estimar la cantidad de analito por interpolación.

Para determinar la linealidad se prepara una serie de, al menos, cinco
diluciones de un estándar, las cuales deben estar de acuerdo con las
cantidades esperadas de analito en la muestra. Se efectúa el análisis
siguiendo exactamente el procedimiento descrito.
 En procedimientos cromatográficos se recomienda efectuar las inyecciones
por triplicado, a no ser que se use un patrón interno.. Para Absorción
atómica a lo menos el promedio de 3 lecturas por concentración.
El coeficiente de correlación(r)








a) Coeficiente de correlación (r).
El coeficiente de correlación refleja el grado de relación o ligazón entre las
variables x (concentración), y (respuesta). El valor r = 1 indica una recta
perfectamente lineal de pendiente positiva, r = -1 una recta perfectamente lineal de
pendiente negativa y r =0 la no correlación entre x e y. En análisis químico se
obtienen valores de r elevadas, iguales o superiores a 0,999, si bien en análisis de
trazas se aceptan valores mas bajos (iguales o superiores a 0,99).
Sin embargo, el mejor indicador del modelo lineal no es r sino un test estadístico, en
el cual se calcula un valor tr (n-2 grados de libertad y se compara con el valor de t
tabulado para el nivel de confianza requerido. En este caso si tr es mayor que el t de
tabla, significa que existe una correlación lineal entre x e y, para el nivel de confianza
requerido.
r (n-2)__
(1-r2)
Donde:
r = coeficiente de correlación
n = numero de mediciones
tr =
Curva de calibración que
relaciona respuesta
 área, alturas, absorbancia, etc., con concentración o cantidad de analito. La
cual posteriormente se gráfica para su documentación e interpretación
estadística.






La recta de calibración es del tipo:
y = bx + a
Donde:
x = corresponde a la concentración
y = corresponde a la respuesta
b = el valor de la pendiente o variación de respuesta por unidad de
concentración.
a = el termino independiente o intercepto sobre el eje Y.
 Interpretación estadística de la regresión lineal.

La representación gráfica suele ser suficiente. Sin embargo conviene
efectuar una interpretación estadística de la regresión lineal.
b) Significación estadística de la
varianza de la pendiente b







La pendiente b se llama también coeficiente de regresión, y se
determina como parámetro indicativo de la sensibilidad, el cual a
mayor pendiente, mayor sensibilidad (respuesta del método frente a
los cambios de concentración del analito). La varianza de la
pendiente Sb2 se utiliza como expresión matemática de la
linealidad, a menor varianza mejor linealidad, para expresar la
linealidad también se utiliza la desviación estándar de la pendiente
Sb y el coeficiente de variación (%CV)
A su vez los limites de confianza de la pendiente se hallan a partir
de la expresión:
b + t Sb
Donde:
b = valor de la pendiente
t = valor de la distribución de Student para n-2 grados de libertad
para el grado de confianza escogido.
Sb = desviación estándar de la pendiente.
c) Significación estadística de la
varianza de la ordenada al origen





El valor de a ( ordenada al origen), se determina para verificar si la
recta pasa por el origen y que cualquier desviación puede
adjudicarse únicamente a valores aleatorios, por lo que en un caso
ideal debe ser cero. Al igual que en el caso de la pendiente para
poder obtener los intervalos de confianza de la ordenada al origen
se calcula en función de su varianza Sa2, su desviación estándar
Sa. Y estos se hallan a través de la formula:
a+ t Sa
Donde:
a = valor de la ordenada al origen.
t = valor de la distribución de student para n-2 grados de libertad
para el grado de confianza escogido.
Sa = desviación estándar de a
Precisión

La precisión es el grado de concordancia entre los valores de
una serie repetida de ensayos analíticos efectuados sobre una
muestra homogénea o, expresado de otra forma, la dispersión de
los valores analíticos alrededor de su media. La precisión indica la
capacidad del método para dar resultados semejantes cuando se
aplica repetidamente a una muestra.

La precisión se expresa matemáticamente por la media para el
valor central y la desviación estándar para la dispersión de los
resultados, y más comúnmente por la desviación estándar relativa
(RSD).

La precisión requiere del análisis sobre una muestra y la
precisión así obtenida se denomina del método, puesto que incluye
todo el procedimiento analítico, desde la preparación de la muestra
hasta la lectura instrumental. También se puede determinar
directamente la precisión del sistema, hallando la variabilidad de
respuesta de una solución patrón. Por lo que la precisión se
distinguirá en 2 tipos de estudios:

Precisión
 -Precisión del sistema: la cual evalúa la dispersión de al menos 6




inyecciones del estándar o repeticiones de lecturas de
absorbancias.
-Precisión del método: evaluando la dispersión de varias
preparaciones de la muestra final homogénea
A su vez la precisión deberá medirse en condiciones
repetitivas, es decir, mismas condiciones, sobre la misma muestra,
por un mismo analista, en el mismo laboratorio, el mismo día y con
los mismos aparatos y reactivos.
También debe medirse en condiciones reproducibles, es decir,
medir la precisión de un método, efectuado sobre la misma muestra
pero en condiciones diferentes, analistas, aparatos, días, etc.
El cociente repetibilidad/reproducibilidad, es de gran utilidad
para evaluar la precisión de un método analítico. Su valor según
estudios realizados por la AOAC es normalmente comprendido
entre 1,5 y 2. Valores mayores a 2 son indicadores de un método
muy personal y valores inferiores a 1,5 indican pobre repetibilidad.
Precisión
 Los criterios de aceptación pueden ser variables, por ejemplo la USP indica








una RSD del sistema de no más de 2%, inyectando 5 veces una solución
estándar. Existen tablas que relacionan la RSD máxima aceptable para un
método analítico en función de los límites de aceptación y del número de
réplicas.
En muchos casos debe indicarse el intervalo de confianza de la
medida, es decir el rango en el cual se encuentra presente el analito,
preferentemente, cuando el numero de muestras es pequeño (menor de
30), las medidas independientes, y la distribución normal, puede calcularse
de acuerdo a la distribución de Student según la formula:
X - t, x S <  < X + t, x S
n
n
Donde:
X = promedio de las mediciones
t, = es el valor de Student, tabulado para n mediciones con = n-1 grados
de libertad y para el nivel  de confianza empleado, generalmente 95%.
S = desviación estándar de las mediciones
n = numero de mediciones.
Sensibilidad

La sensibilidad de un método analítico se relaciona con
la cantidad mínima de analito requerida para dar un
resultado significativo, cualitativo o cuantitativo. Debe
distinguirse entre sensibilidad de calibrado y sensibilidad
analítica.
 a) Sensibilidad de calibrado: corresponde a la pendiente
de la recta de calibración, es decir, la señal o respuesta por
unidad de concentración.
 b) Sensibilidad analítica: corresponde a la sensibilidad de
calibrado dividida por la desviación estándar de la
respuesta.

Los parámetros a definir para poder evaluar la
sensibilidad de un método analítico son los limites de
detección y de cuantificación.
Los pasos a seguir son los siguientes:
 a) Se determina la pendiente de la curva de calibración
(concentración v/s respuesta) en el rango apropiado:
 b) Se realiza otra curva de calibración, inyectando cada
punto por triplicado, pero en este caso para
concentraciones menores de analito, determinándose la
ecuación de esta nueva recta de calibración y se
extrapola la respuesta a concentración cero,
obteniéndose un estimado de la respuesta del blanco: Ybl
 c) Se determina la desviación estándar correspondiente a
cada concentración del punto 2, se calcula la recta
correspondiente a concentración v/s s y se extrapola
como en el caso anterior la desviación estándar a
concentración cero, obteniéndose el estimado
correspondiente a la desviación estándar del blanco: Sbl
a) Limite de detección:
 corresponde según la USP XXII, a la menor






concentración de analito en una muestra que puede ser
detectada, pero no necesariamente cuantificada, bajo
las condiciones experimentales establecidas y se
expresa en unidades de concentración (%, ppm, ppb,
etc.). Se calcula como:
Limite de detección = Ybl + 3 Sbl_
b
Donde:
Ybl = valor estimado de la respuesta del blanco.
Sbl = desviación estándar estimada del blanco
b = pendiente de la curva de calibración.
b) Limite de cuantificación:
 según USP XXII, la menor concentración de analito de una muestra
que puede ser cuantificada con precisión y exactitud aceptable bajo
las condiciones experimentales establecidas y se expresa también
en unidades de concentración. Se calcula según:







Limite de cuantificación: = Ybl + 10 Sbl_
b
Donde:
Ybl = valor estimado de la respuesta del blanco.
Sbl = desviación estándar estimada del blanco
b = pendiente de la curva de calibración.
Los límites de detección y cuantificación se estiman a partir de
la curva de regresión o calibración, siempre que se hayan
considerado concentraciones bajas de analito, por extrapolación a
concentración cero.
Exactitud.
La exactitud de un método, también conocida como
error sistemático o tendencia, corresponde a la
capacidad del método analítico para dar resultados lo
más próximos posibles al valor verdadero. La exactitud o
bien podríamos llamarla inexactitud, debe ser tan
pequeña como sea posible, para que el valor promedio
se aproxime al de referencia, es decir, la recuperación
del analito debe acercarse al 100%.

No deben confundirse exactitud y precisión. La
precisión está relacionada con la dispersión de una serie
de mediciones, pero no da ninguna indicación de lo
cerca que están del valor verdadero. Se pueden tener
mediciones muy precisas pero poco exactas.

Exactitud.
 Matemáticamente la exactitud se expresa en forma de porcentaje






de recuperación de la cantidad de analito presente en la muestra, o
bien en forma de diferencia entre el valor hallado y el valor
verdadero. Si bien el valor verdadero de concentración no se
conoce sino que solo puede estimarse, es posible preparar una
muestra por un procedimiento más exacto, y utilizarla como
referencia.
Recuperación: R= X_ x 100
X
Donde:

X = valor verdadero
X = promedio de las mediciones
Exactitud
 En el análisis de trazas (micro componentes), no siempre
se alcanzan recuperaciones tan elevadas y se consideran
valores habituales de recuperación entre el 60 y 80%.
Para determinar si el valor medio hallado y el valor
considerado verdadero no difieren significativamente, para
esto se efectúa un test estadístico, como lo es el test de
Student, para un nivel de confianza determinado. El test
de Student emplea, al menos, 3 concentraciones del
analito, preparadas por triplicado, comprendidas dentro del
rango de linealidad del sistema, en general se utilizan
concentraciones correspondientes al 80, 100 y 120% del
valor esperado.
Exactitud.








En este caso, el valor de t se calcula como:
texp = (100-R)_
RSD x n
Donde:
R = recuperación porcentual.
RSD = desviación estándar relativa de las mediciones
n = número de repeticiones
Los valores de texp se comparan con los tabulados
para el intervalo de confianza requerido con n-1 grados
de libertad, y la exactitud se evalúa para el promedio de
recuperación de todas las concentraciones. Si texp <
ttabla, no existe diferencia significativa con el 100% de
recuperación y la exactitud es apropiada. (1)
Test de ANOVA- homogeneidad
Exactitud
Sodio
Método Espectrofotometría de
Absorción atómica
Papel biológico
 El catión sodio (Na+) tiene un papel
fundamental en el metabolismo celular, por
ejemplo, en la transmisión del impulso nervioso
(mediante el mecanismo de bomba de sodiopotasio). Mantiene el volumen y la osmolaridad.
Participa, además del impulso nervioso, en la
contracción muscular, el equilibrio ácido-base y
la absorción de nutrientes por las células.
 La concentración plasmática de sodio es en
condiciones normales de 135 - 145 mmol/l. El
aumento de sodio en la sangre se conoce como
hipernatremia y su disminución hiponatremia
Compuestos









Los compuestos de sodio de mayor importancia industrial son:
Sal común (NaCl).
Carbonato de sodio (Na2CO3).
Bicarbonato de sodio (NaHCO3).
Sosa cáustica (NaOH). El hidróxido de sodio, más conocido como soda
cáustica, es una base muy fuerte y corrosiva usada en productos
destinados a la limpieza de desagües y al desengrase de hornos. Cuando
se disuelve en agua produce una reacción muy exotérmica (-42,9 kJ/mol).
Su poder corrosivo hace de la soda cáustica un compuesto letal para los
tejidos vivos y los compuestos orgánicos, e incluso puede atacar al vidrio
en caso de que el contacto sea permanente. En presencia del dióxido de
carbono atmosférico produce carbonato de sodio, por lo que sus soluciones
son poco estables.
Nitrato de sodio (NaNO3).
Tiosulfato de sodio (Na2S2O3 · 5H2O).
Bórax (Na2B4O7 · 10H2O).
Yoduro de sodio (NaI)
Sodio en la dieta
 La mayor fuente de sodio es el cloruro de sodio o una ración común
de sal, del cual el sodio constituye el 40%. Sin embargo, todos los
alimentos contienen sodio en forma natural, siendo más
predominante la concentración en alimentos de origen animal que
vegetal. Aproximadamente 3 gr. de sodio están contenidos en los
alimentos que se consumen diariamente, sin la adición de cloruro
de sodio o sal común, esto es importante considerarlo en pacientes
que tengan una restricción o disminución en la ingesta de sal diaria
(pacientes nefrópatas, diabéticos, hipertensos). El requerimiento de
sodio es de 500 mg /día aproximadamente (3). La mayoría de las
personas consumen más sodio que el que fisiológicamente
necesitan, para ciertas personas con presión arterial sensible al
sodio, esta cantidad extra puede causar efectos negativos sobre la
salud.
REFERENCIAS
 AOAC Official Method 985.35. AOAC Official
Methods of Analysis (2005). Cp. 50, p.15.
 M Series Atomic Absorption, Manual de
operación,1999-2006 Thermo Electron
Manufacturing Ltda.
 Spectrometers Manual de Métodos, 9499 230
24011, Issue 4 280804. Thermo Electron
Corporation
Optimización del equipo








1.- Realizar la puesta a punto y optimización de las condiciones del
espectrofotómetro (ajuste de quemador y lámpara) para el metal a determinar
siguiendo las indicaciones del manual o instructivo del equipo de medición.
2. Aspirar por el capilar del quemador blanco y haga autocero. Ajustar la sensibilidad
con concentración de estándar referencial indicado en el manual para lograr la
máxima sensibilidad.
3. Aspirar las soluciones estándares de la curva de calibración en orden decreciente
por el capilar del quemador y leer en E.A.A. Para realizar la calibración se deben
usar a lo menos 3 estándar y un blanco. El coeficiente de correlación de la curva de
regresión lineal debe ser > 0,99.
4. Aceptar curva de calibración, aspirar un material de referencia control o una
solución control del analito a analizar, verificar que se encuentra dentro del rango de
aceptabilidad.
5. Proceder a realizar las lecturas de las muestras en el EAA.
6. Las lecturas son obtenidas por interpolación desde la curva de calibración y están
expresados en mg/L del analito correspondiente.
7. En caso, de que el valor este fuera de rango del máximo de la curva de
calibración, realice una dilución y registre el valor del factor de dilución (F.D.)
aplicado.
8. Registre los valores obtenidos.
Reactivos









6.3.1. Solución estándar stock comercial de multielementos de metales, 100 mg/L, certificada.
6.3.2. Solución estándar stock comercial de Sodio 1000 mg/L, certificada.
6.3.3. Gases calidad AAS: Acetileno 99.99% , Oxido nitroso 99.99%.
6.3.4. Agua grado reactivo, destilada o desionizada, tipo I.
6.3.5. Acido nítrico (HNO3) 65% 14 N, calidad AAS.(suprapur)
6.3.6. Acido clorhídrico (HCl) 37%, p.a.
6.3.7. Oxido de lantano (La2O3), 99.99%, calidad AAS.
6.3.8. Solución de cloruro de lantano ( LaCl3, 1% p/v): Pesar 11,7 g (+/- 100mg) de La2O3 y
llevar a un matraz aforado de 1L, agregar un poco de agua grado reactivo para disolver el polvo,
agregar bajo campana lentamente 50 mL de HCl 37% ( Precaución: ¡Reacción exotérmica!).
Agitar suavemente, hasta disolver todo el reactivo y luego aforar con agua grado reactivo. Estable
6 meses a temperatura ambiente.
6.3.9. Solución de ácido nítrico 20% v/v para eliminación de trazas en lavado de material: En un
contenedor de plástico para lavar material, agregar 5 l de agua grado reactivo, luego, medir 1L de
HNO3 65% con una probeta, verter agitando lentamente al contenedor con el agua grado reactivo
y mezclar suavemente.
6.3.10. Solución de ácido nítrico 1M: en un matraz de 1 L agregar unos 200 mL de agua grado
reactivo, luego medir 71,5 mL de HNO3 65% 14N y agregar bajo campana lentamente al matraz
(Precaución: ¡Reacción exotérmica!), aforar con agua grado reactivo y agitar. Almacenar en
frasco vidrio o plástico ámbar. Duración 6 meses a temperatura ambiente.
Selectividad Sodio

Para determinar la selectividad se
utilizó un material de referencia matriz
liquida multielementos trazables al NIST,
con adición de oxido de lantano acorde a
la metodología analítica, con lo cual se
pudo observar que el método presenta
una buena selectividad.
Determinación de Sodio
Digestión de la muestra
 Moler y homogeneizar la muestra ..
 Pesar exactamente en un crisol + 3 g de muestra dependiendo de la
concentración esperada del o los analitos. Registre el peso.
 Colocar el crisol con la muestra sin tapar en placa calefactora,
estufa o mufla a 100º C por 30 minutos.
 Colocar el crisol con la muestra tapado en mufla a 525ºC por un
periodo de 3 a 5 hrs (< 8 hrs), hasta obtener cenizas blancas. De
obtenerse cenizas grises dejar enfriar y agregar al crisol de 0,5 a 3
mL aproximadamente de HNO3 65%, colocar el crisol destapado en
placa calefactora a unos 100ºC, hasta evaporar. (realizar
procedimiento bajo campana extractora de gases).Luego llevar
nuevamente mufla a 525ºC por 1 a 2 hrs hasta cenizas blancas.
 Digerir las cenizas blancas contenidas en el crisol con 5 mL de
HNO3 1M en placa calefactora cuantitativamente llevar el licor de
cenizas a un matraz aforado de 50 mL, a través de 2 lavados con
porciones de alrededor de 3 mL de HNO3 1M, agregar al matraz 5
mL de LaCl3, 1% p/v y aforar con HNO31M. La solución esta lista
para ser leída.
Sodio 1
Sodio 2
Hierro
Método Espectrofotometría de
Absorción atómica con Llama
Metabolismo del hierro










Aunque solo existe en pequeñas cantidades en los seres vivos, el hierro ha asumido en papel
vital en el crecimiento y en la supervivencia de los mismos y es necesario no solo para lograr una
adecuada oxigenacion tisular sino también para el metabolismo de la mayor parte de las células.
El hierro es el elemento numero 26 en la tabla periódica y tiene un peso atómico de 55,85. Es el
cuarto elemento en abundancia y el segundo metal más abundante en la corteza terrestre. El
hierro fue seleccionado en la evolución de los tiempos de entre muchos metales transicionales
para formar la ENERGIA VITAL en la fisiología de los vertebrados.
En la actualidad con un incremento en el oxigeno atmosférico el hierro se encuentra en el medio
ambiente casi exclusivamente en forma oxidada (ó ferrica ó Fe+++) y en esta forma es poco
utilizable.
En los adultos sanos el hierro corporal total es de 3 a 4 gramos ó 35 mg/kg en las mujeres a 50
mg/kg en los hombre se encuentra distribuido en dos formas:
70% como hierro funcional (2.8g):
Eritrocitos (65%).
Tisular: mioglobinas (4%).
Enzimas dependientes del hierro (hem y no hem): 1%
Estas son enzimas esenciales para la función de las mitocondrias y que controlan la oxidación
intracelular (citocromos, oxidasas del citrocromo, catalasas, peroxidasas).
Transferrina (0.1%), la cual se encuentra normalmente saturada en 1/3 con hierro.
La mayor atención con relación a este tipo de hierro se ha enfocado hacia el eritrón, ya que su
estatus de hierro puede ser fácilmente medible y constituye la principal fracción del hierro
corporal.












30% como hierro de depósito (1g):
Ferritina (2/3).
Hemosiderina (1/3).
Hemoglobina: transporta el oxigeno a las celulas.
Transferrina: transporta el hierro a través del plasma.
Ferritina: principal forma de deposito del hierro en los tejidos.
Estudios recientes de disponibilidad del hierro de los alimentos han demostrado que el hierro del
hem es absorbido bien, pero el hierro no hem se absorbe en general muy pobremente y este
ultimo es el hierro que predomina en la dieta de gran cantidad de gente en el
mundo.[cita requerida]
Hem: como hemoglobina y mioglobina, presente principalmente en la carne y derivados. No hem.
La absorción del hierro hem no es afectada por ningun factor ni dietetico, ni de secreción
gastrointestinal. Se absorbe tal cual dentro del anillo porfirinico. El hierro es liberado dentro de las
celulas de la mucosa por la HEM oxigenasa, enzima que abunda en las celulas intestinales del
duodeno.
Las absorción del hierro no hem, por el contrario se encuentra afectada por una gran contidad de
factores dieteticos y de secreción gastrointestinal que se analizanran posteriormente.
El hierro procedente de la dieta, especialmente el no hem, es hierro férrico y debe ser convertido
en hierro ferroso a nivel gástrico antes que ocurra su absorción en esta forma (hierro ferroso) a
nivel duodenal principalmente.
Otros factores, independientes de la dieta que pueden influir en la absorción del hierro son:
Funciones Hierro









El hierro se encuentra en prácticamente todos los seres vivos y cumple numerosas y variadas funciones.
Hay distintas proteínas que contienen el grupo hemo, que consiste en el ligando porfirina con un átomo de hierro.
Algunos ejemplos:
 La hemoglobina y la mioglobina; la primera transporta oxígeno, O2, y la segunda lo almacena.
 Los citocromos; los citocromos c catalizan la reducción de oxígeno a agua. Los citocromos P450 catalizan
la oxidación de compuestos hidrofóbicos, como fármacos o drogas, para que puedan ser excretados, y
participan en la síntesis de distintas moléculas.
 Las peroxidasas y catalasas catalizan la oxidación de peróxidos, H2O2, que son tóxicos.
Ejemplo de centro de una proteína de Fe/S (ferredoxina)
Las proteínas de hierro/azufre (Fe/S) participan en procesos de transferencia de electrones.
También se puede encontrar proteínas en donde átomos de hierro se enlazan entre sí a través de enlaces puente
de oxígeno. Se denominan proteínas Fe-O-Fe. Algunos ejemplos:
 Las bacterias metanotróficas, que emplean el metano, CH4, como fuente de energía y de carbono, usan
proteínas de este tipo, llamadas monooxigenasas, para catalizar la oxidación de este metano.
 La hemeritrina transporta oxígeno en algunos organismos marinos.
 Algunas ribonucleótido reductasas contienen hierro. Catalizan la formación de desoxinucleótidos.
Los animales para transportar el hierro dentro del cuerpo emplean unas proteínas llamadas transferrinas. Para
almacenarlo emplean la ferritina y la hemosiderina. El hierro entra en el organismo al ser absorbido en el intestino
delgado y es transportado o almacenado por esas proteínas. La mayor parte del hierro se reutiliza y muy poco se
excreta.
Tanto el exceso como el defecto de hierro pueden provocar problemas en el organismo. El envenamiento por
hierro ocurre debido a la ingesta exagerada de esté (como suplemento en el tratamiento de anemias).
La hemocromatosis corresponde a una enfermedad de origen genético, en la cual ocurre una excesiva absorción
del hierro, el cual se deposita en el hígado, causando disfunción de este y eventualmente llegando a la cirrosis
hepática. En las transfusiones de sangre se emplean ligandos que forman con el hierro complejos de una alta
estabilidad para evitar que quede demasiado hierro libre.
Estos ligandos se conocen como sideróforos. Muchos microorganismos emplean estos sideróforos para captar el
hierro que necesitan. También se pueden emplear como antibióticos, pues no dejan hierro libre disponible .
REFERENCIAS
 Official methods of analysis AOAC 15 th
edition, vol 2, pág 1106,1107, año 1990
 M Series Atomic Absorption, Manual de
operación,1999-2006 Thermo Electron
Manufacturing Ltda.
 Spectrometers Manual de Métodos,
9499 230 24011, Issue 4 280804.
Thermo Electron Corporation
Selectividad

Dada que las líneas de emisión de la lámpara del
cátodo hueco de Fe son muy estrechas es rara la
interferencia. Si interfiere en la dispersión de la luz la
combustión incompleta de la matriz orgánica o
Interferente espectral hierro 213,859 nm y el Zinc
213,856 lo cual produce una sobreposición de 0,003 nm
 Para determinar la selectividad se utilizó una matriz de
harina sin fortificar (grado de extracción, 78%), y una
matriz de harina con adición de estándar de hierro y
sulfato y pirofosfato de hierro con lo cual se pudo
observar que el método presenta una buena
selectividad, ya que las matrices no se ven afectadas
por la presencia de otros analitos interferentes
Reactivos, insumos











Matraces aforados de 50 mL
Piseta
Espátula, toalla absorbente, plumón permanente
Cápsulas de porcelana para digestión de 25cm de diámetro
Elementos de seguridad como guantes y anteojos
Balanza analítica sensibilidad 0.1 mg
Campana de extracción de gases
Espectrofotómetro de absorción atómica con llama
Homogeneizador de muestras
Plancha calefactora
Agua para análisis, desionizada
Ácido clorhídrico 37 % p.a.
Ácido nítrico 65% p.a
Estándar de Hierro o multielementos
Lámpara de hierro
Micropipeta de 100ul a 1000 ul
Curva de calibración de
estándares
1.- Estándares de hierro solución concentrada de
1000 mg/L. o St multielemenos 100 ppm
2.- Estándar de 5 mg/L: tomar 0,5 mL del estándar
concentrado de 1000 mg/L + 5 mL de HCL
concentrado y aforar a 100 mL con agua desionizada.
3.- Estándar de 2 mg/L: tomar 0,2 mL del estándar
concentrado de 1000 mg/L + 5 mL de HCL
concentrado y aforar a 100 mL con agua desionizada.
4.- Estándar de 1 mg/L: tomar 0,1 mL del estándar
concentrado de 1000 mg/L + 5 mL de HCL
concentrado y aforar a 100 mL con agua desionizada
Condiciones del equipo de FLAA









Longitud de Onda
248,3 nm
Franja de paso (slite)
0,2 nm
Tipo de Llama
Aire-acetileno
Flujo de Combustible
0,8 a1,0 L/min
Corriente de la lámpara 75
Tipo de señal
Continua
T° de ignición
800°C
T° de atomización
2300 °C
Corrector de background on
Determinación de Hierro
Digestión de la muestra
 Moler y homogeneizar la muestra ..
 Pesar exactamente en un crisol + 3 g de muestra dependiendo de la
concentración esperada del o los analitos. Registre el peso.
 Colocar el crisol con la muestra sin tapar en placa calefactora,
estufa o mufla a 100ºC por 30 minutos.
 Colocar el crisol con la muestra tapado en mufla a 550ºC por un
periodo de 5 a 6 hrs (< 8 hrs), hasta obtener cenizas blancas. De
obtenerse cenizas grises dejar enfriar y agregar al crisol de 0,5 a 3
mL aproximadamente de HCL 1:1 colocar el crisol destapado en
placa calefactora a unos 100ºC, hasta evaporar. (realizar
procedimiento bajo campana extractora de gases).Luego llevar
nuevamente mufla a 550ºC por 1 a 2 hrs hasta cenizas blancas.
 Digerir las cenizas blancas contenidas en el crisol con 5 mL de HCL
1:1 en placa calefactora cuantitativamente llevar el licor de cenizas
a un matraz aforado de 50 mL, a través de 2 lavados con porciones
de alrededor de 3 mL de HCL 1:1, aforar con agua. La solución esta
lista para ser leída.
Test de ANOVA- homogeneidad
Interpretación, cálculos, expresión e
informe
de los resultados
 Para calcular la concentración de sodio o hierro en la muestra en
mg/kg, aplique la siguiente formula:

 mg/Kg del analito = L x 50 x F.D.

P
 L: Lectura de la concentración en mg/L obtenida por la interpolación




de la curva de calibración.
FD: Factor de dilución. En caso de no realizar ninguna dilución, es
igual a 1.
P: Peso de la muestra en gramos
Los resultados obtenidos se expresan en muestras sólidas mg/Kg o
en muestras líquidas mg/L
ENO sodio en mg/100g y mg/porción de consumo habitual
ÁCIDO ASCÓRBICO
Método J.Tillman
La Vitamina C o enantiómero L
del ácido ascórbico,
 es un nutriente esencial para los primates superiores y
un pequeño número de otras especies. La presencia de
esta vitamina es requerida para un cierto número de
reacciones metabólicas en todos los animales y plantas
y es creada internamente por casi todos los organismos,
siendo los humanos una notable excepción. Es
ampliamente sabido que su deficiencia causa escorbuto
en humanos,1 2 3 de ahí el nombre de ascórbico que se
le da al ácido. Es también ampliamente usado como
aditivo alimentario.
 El farmacóforo de la vitamina C es el ion ascorbato. En
organismos vivos, el ascorbato es un antioxidante, pues
protege el cuerpo contra la oxidación, y es un cofactor
en varias reaciones enzimáticas vitales.
Efectos La vitamina C
 ayuda al desarrollo de dientes y encías, huesos,
cartílagos, a la absorción del hierro, al crecimiento y
reparación del tejido conectivo normal (piel más suave,
por la union de las células que necesitan esta vitamina
para unirse), a la producción de colágeno (actuando
como cofactor en la hidroxilación de los aminoácidos
lisina y prolina), metabolización de grasas, la
cicatrización de heridas. Su carencia ocasiona el
escorbuto, también resulta esta vitamina un factor
potenciador para el sistema inmune aunque algunos
estudios ponen en duda esta última actividad de la
vitamina C.
Indicaciones

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
La Vitamina C es esencial para el desarrollo y mantenimiento del organismo, por lo que su consumo es obligatorio
para mantener una buena salud.
La vitamina C sirve para:
Evitar el envejecimiento prematuro (proteger el tejido conectivo, la "piel" de los vasos sanguíneos).
Facilita la absorción de otras vitaminas y minerales.
Antioxidante.
Evita las enfermedades degenerativas tales como arteriosclerosis, cáncer, enfermedad de Alzheimer.
Evita las enfermedades cardíacas (tema tratado más adelante).
Desde los descubrimientos de Linus Pauling se aseveraba que la vitamina C reforzaba el sistema inmune y
prevenía la gripe, pero investigaciones realizadas en los 1990s parecen refutar esta teoría y, en todo caso, han
demostrado que el consumo en exceso (a diferencia de lo preconizado por Pauling y sus seguidores) de
suplementos de vitamina C son poco recomendables, porque,entre otras cosas, un consumo excesivo puede
provocar alteraciones gastrointestinales.
Requerimientos diarios
El ser humano parece ser extremadamente eficiente en la reutilización de la vitamina C, por lo que sus
requerimientos son 50 veces menores que en el resto de los simios. Al ser una vitamina hidrosoluble su
eliminación por el riñón por diuresis es extremadamente eficaz, por lo que los excesos se pueden eliminar en
menos de cuatro horas. Todo ello hace que haya muy poco consenso en cual es la cantidad mínima y la cantidad
máxima. Prueba de ellos damos las siguientes referencias:
40 miligramos por día: Food Standards Agency1 del Reino Unido
45 miligramos por día: La Organización Mundial de la Salud4
60–95 miligramos por día: National Academy of Sciences5 de los Estados Unidos. Segun este organismo no se
deben exceder los 2000 miligramos por día.
400 miligramos por día: the Linus Pauling Institute.6
1.000 miligramos por día: Profesor Roc Ordman, para la investigación de los radicales libres.7
3.000 miligramos por día (hasta 300.000 mg para enfermos): La Fundación para la vitamina C.8
6.000–12.000 miligramos por día: Thomas E. Levy, Colorado Integrative Medical Centre.9
6.000–18.000 miligramos por día: Dosis que ingiere Linus Pauling.10
3.000–200.000 miligramos por día: Robert Cathcart va subiendo la dosis hasta que aparece una diarrea.
Entonces recomienda la dosis más elevada que no cause diarrea al paciente.11
Efectos Adversos
 Se considera que las necesidades diarias
de ácido ascórbico para un adulto no
exceden de los 60 mg y que cantidades
superiores a los 3 g diarios causan
acidificación de la orina e incrementan el
consiguiente riesgo de cálculos urinarios
Otros Usos
 El ácido ascórbico y sus sales ascorbatos de sodio, potasio y calcio
se utilizan de forma generalizada como antioxidantes y aditivos.
Estos compuestos son solubles en agua por lo que no protegen a
las grasas de la oxidación; para este propósito pueden utilizarse los
ésteres del ácido ascórbico solubles en grasas con ácidos grasos
de cadena larga (palmitato y estearato de ascorbilo).
 Principales fuentes naturales
 Las principales fuentes naturales de vitamina C que actualmente se
conocen son todas vegetales, principalmente ciertas frutas (las que
poseen colores rojos o azulados suelen ser ricas en ácido
ascórbico), a continuación se enumeran los principales vegetales
que hacen aporte de esta vitamina: " — grosella negra (Ribes
nigrum), los ajís, chiles, pimientos, morrones, pimentones, el perejil,
la guayaba, el fruto kiwi, el brécol o broccoli (Brassica oleracea
italica), el híbrido llamado loganberry, la grosella (Ribes rubrum) el
repollito de Bruselas también conocido como col de Bruselas, el goji
(Lycium barbarum), el lichi (Litchi chinensis) entre otros, sin
embargo en gran parte del mundo de cultura "Occidental" las
fuentes más comunes para obtener vitamina C suelen ser los citrus:
limón, naranja, pomelo, bergamota y, fuera de los citrus, el tomate.






la vitamina C es una de las vitaminas que intervienen en el funcionamiento del
sistema inmunológico, como lo hacen la vitamina A y la tiamina. También es muy
importante como vitamina antioxidante, lo que de una u otra manera protege a
nuestro organismo de radicales libres u otras sustancias tóxicas. Por otro lado, al ser
hidrosoluble, el exceso es fácilmente eliminado en la orina.
Como curiosidad puede señalarse que esta vitamina sólo es esencial en unos pocos
animales: los monos antropoides, el ser humano que ha perdido la capacidad de
sintetizarla naturalmente en su cuerpo; el ruiseñor chino, una especie de trucha, los
cuyes y los murciélagos frugívoros.
Tipos de vitamina
La vitamina C se divide en naturales y sintéticas. Las naturales se dividen en ácido
ascórbico y ascorbato de sodio; por su parte las sintéticas pueden tener distintas
variaciones.
Las ventajas de la vitamina C sintéticas es su bajo precio y su fabricación pues su
materia prima es el petróleo, sus desventajas son su baja efectividad y los efectos
secundarios que conlleva el consumo de elementos minerales en reemplazo de
vegetales.
En cambio, la vitamina C natural es sumamente efectiva, y de muy bajo precio pues
está presente en casi toda las frutas y vegetales (cítricos de preferencia); su
problema radica en que al extraerse y convertirse en cristales toma un fuerte sabor a
limón no bien tolerado por personas con sensibilidad en su estomago
REFERENCIAS
 Association of Official Analytical Chemists
985.33 (1995)
 United State Pharmacopeia U.S.P. XXIII
 Methods for the determination of vitamins
in food, G. Brubacher Muller Mulot and
A.T. Southgate
Selectividad Ácido Ascórbico
Método J.Tillman

La determinación oxidimétrica no es
muy selectiva ya que la presencia de
otros analitos interferentes (compuestos
reductores, SO2,etc) tienden a producir
gastos elevados del titulante 2,6DFIF, con
lo cual generalmente da como resultados
valores sobreestimados.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
 El método es aplicable a productos con o
sin almidón productos heterogéneos,
verduras, frutas, leche y productos a base
de leche.
Reactivos






1.- Ácido L(+) ascórbico estándar
2.- Ácido meta-fosfórico p.a
3.- Ácido acético p.a
4.- 2,6-diclorofenol-indofenol sal sódica p.a
5.- EDTA sal sódica del ácido etilendiaminotetraacético.
6.- Solución estándar de ácido ascórbico.- 1mg/mL. Pesar con exactitud
50 mg de Acido L(+) ascórbico estándar (U.S.P., B.P.). Transferir a un
matraz volumétrico de 50 mL. Diluir al volumen con la solución de ácido
meta-fosfórico al 2%.
 7.- Solución ácido meta-fosfórico.- Disolver con agitación 15 mg de pellets
de HPO3 glacial en 40 mL de ácido acético glacial y 150 mL de H2O. Aforar
a 250 mL con H2O y filtrar rápidamente a través de un papel filtro plegado
cuantitativo (Whatman Nº 541, rápido, 18,5 cm u otro equivalente).
 8.- Solución de EDTA.- Disolver con agitación 0,9 g de EDTA en 200 mL de
H2O.
 9.- Solución precipitante.- Mezclar inmediatamente antes de su uso en
volúmenes iguales de la solución de EDTA y ácido meta-fosfórico.
Extracción
 Extracción del ácido ascórbico mediante ácido
meta-fosfórico, en donde el ácido ascórbico
reduce el indicador de oxido-reducción 2,6diclorofenol-indofenol, eliminando el color azul
inicial del compuesto en estado sólido en
solución neutra y alcalina; la solución en medio
ácido es de coloración rosada y se reduce al
derivado leuco, incoloro, el ácido ascórbico se
oxida a ácido dehidroascórbico, lo cual permite
su determinación por volumetría oxidimétrica
Solución estándar
2,6-dicloro fenol-indo fenol sal sódica p.a.
 Disolver 0,0625 de sal sódica en 50 mL de
H2O en un matraz volumétrico de 250 mL
al cual se le adiciona previamente 0,0525 g
de NaHCO3 grado reactivo. Agite
vigorosamente, cuando el colorante esté
disuelto, diluya a 250 mL con H2O. Filtrar a
una botella ámbar utilizando el papel filtro.
Guardar bajo refrigeración.
Valoración del título de la solución de
2,6 diclorofenol-indofenol sal sódica
 Transfiera 2,0 mL de solución estándar Acido L(+) ascórbico a cada




uno de los 3 matraces erlenmeyer que contienen 5 mL de la
solución precipitante cada uno.
Empleando una bureta de 25 mL graduada en 0,05 mL y con una
llave de vidrio o teflón, titular rápidamente con la solución estándar
de indofenol hasta obtener una coloración rosada pálida que
persista por 5 segundos.(Cada titulación debe requerir
aproximadamente 15 mL, y debe corroborarse dentro de  0,1 mL).
Titule 3 blancos compuestos de 7 mL de solución precipitante más
15 mL de H2O. El blanco promedio es 0,1 mL.
Calcule el equivalente del colorante indofenol (F), equivalente a
ácido ascórbico de un mL de la solución estándar de indofenol.
mL DFIF de la titulación del estándar de ácido ascórbico - mL DFIF
de la titulación del blanco = mL DFIF equivalente a 2 mg de ácido
ascórbico (A)
Productos sin o con poco almidón, Ej.leche en polvo
 Preparación de la porción de ensayo.
 Pesar 10 g con una precisión de 0,1 g una cantidad del




producto a analizar que contenga aproximadamente 5 a
10 mg de ácido ascórbico en un matraz de 100 mL con
H2O.
Pipetear 20-40 mL de la disolución y un volumen igual
de la solución precipitante a un vaso de precipitado de
125 mL. Designar el volumen como v y el de la
disolución de la muestra como E.
Mezclar y centrifugar a 5.000 rpm por 5 - 10 min.
Filtrar el sobrenadante utilizando papel filtro.
Designar al filtrado como la solución de ensayo. La
preparación debe realizarse inmediatamente antes de la
determinación.
Productos heterogéneos
 Ej. verdura, fruta
 Homogeneizar una muestra de 50 a 100 g
con un volumen de ácido meta-fosfórico
de 10% representando 1/5 del volumen
total es decir 50 mL de ácido metafosfórico para un matraz de 250 mL y
enrasar con H2O destilada.
 Centrifugar y/o filtrar la solución obtenida
sobre un filtro plegado.
Valoración
 Pipetear tres alicuotas de 10 mL, de cada solución de
ensayo (V), llevar cada una de las alicuotas a matraces
erlenmeyer separados y titular con el DFIF (X).
 En forma similar, titular 2 blancos compuestos cada uno
de 10 mL de la solución precipitante y 10 mL de H2O.
Además agregué un volumen de H2O equivalente a los
mL de la solución estándar de indofenol usados en la
titulación de la solución de ensayo.
 Titule con la solución estándar de indofenol hasta el
mismo color del punto final observado en la titulación de
la alícuota estándar (B). El color rosa debe permanecer
a lo menos 5 segundos.
Cuantificación e
Identificación








Ejemplo leche en polvo
mg ácido ascórbico/100 g de muestra = (X-B) x (A/E) x (V/Y) x (100/0,10)
donde
X = mL promedio obtenido en la titulación de ensayo;
B = mL promedio obtenido de la titulación del blanco
A = mg de ácido ascórbico equivalente a 1 mL de
solución estándar de indofenol
E = volumen de la muestra disuelta
V = volumen de la muestra de ensayo
Y = volumen de solución de ensayo titulada = 10 mL
(100/0,10) = factor para expresar el contenido en 100 g de
producto final.
 Expresión de Resultados.
 Expresar el contenido de ácido ascórbico en mg /100 g de producto final.
Parámetros
Sodio
Hierro
Ácido Ascórbico
Selectividad
Buena
Buena
Relativa (valoración visual
oxidimétrica)
Linealidad
0,9968
0,9995
NA
Rangos de linealidad
0,6-3,0 ppm - 0,2-1,5 ppm
0,5-5,0 ppm
NA
Repetibilidad
0,01
0,02
NA
Reproducibilidad
0,1
0,2
NA
Repetibilidad
4%
2,8
0,7%
Reproducibilidad
15%
6,5
Entre analistas
No exceder de 1,2 mg/50mg/100g
Exactitud
(Recuperación)
111-106 %
100-104%
LD
Menor a 0,2 ppm
0,11
0,25 mg
LC
Mayor a 0,2 ppm
0,38
1,5 mg
-
0,995
% CV Sistema
% CV Método
Sensibilidad
Control de Calidad
 Se efectuarán controles para comprobar la validez de






los ensayos realizados con el método analítico recogido
en este procedimiento.
Nivel I:
Ensayos de intercomparación, utilización de
materiales de referencia certificados y patrones de
referencia certificados, según disponibilidad.
Nivel II: Materiales de referencia con o sin certificación
externa y muestras fortificadas por el analista en la
validación.
Nivel III. Durante el desarrollo de la serie de trabajo se
incluye:
Control de blanco al inicio de las lecturas
Control de estándar de concentración conocida
Repetición del estándar como control por cada diez
muestras.
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Métodos aplicados para hierro y sodio. Ing. Emilia Raymond