Seminario 3
Clonación animal
Obtención de embriones capaces de
desarrollar un organismo completo o
producción de células
multipotenciales, a partir de tejidos
diferenciados mediante la técnica de
transferencia nuclear
Transferencia nuclear
Introducción de núcleos
diferenciados de células de
anfibios ó mamíferos en
huevos anucleados
Los núcleos
espermáticos
se replican con
total eficiencia.
Pero los
núcleos de
eritrocitos no
pueden
replicarse.
Pregunta….
¿¿¿Es necesario el pasaje por mitosis
para reprogramar los núcleos para la
rápida replicación del ADN???
Pregunta….
¿¿¿La remodelación de la cromatina
en los núcleos de los eritrocitos
durante la mitosis afecta el tamaño
de los replicones???
Núcleos de eritrocitos + extracto de huevo + BrdUTP + aphidicolin
en fase M o S
DNA combing
*Ubicación de las fibras
anticuerpo
a- guanosina +
anticuerpo secundario
con fluoróforo
*Incorporación de BrdUTP
anticuerpo
a-BrdU
+ anticuerpo secundario
con fluoróforo
77% <
30kpb
97% >
30kpb
74% 1030 kpb
• La replicación lenta en los eritrocitos
en fase S se debe a una baja
frecuencia de orígenes de replicación.
• La exposición de los núcleos de
eritrocitos a un extracto en fase M
genera un espaciamiento de los
orígenes de replicación similar al
núcleo espermático
Pregunta…
¿¿¿Es suficiente la formación de
cromosomas mitóticos para
reprogramar la organización nuclear
de eritrocitos para que se produzca la
rápida replicación de DNA en el
siguiente ciclo celular???
•Acetilación de histonas requerida
para una rápida replicación
•Nivel de acetilación máximo en
núcleos de eritrocitos en extracto
interfásico
•Efecto dominante de la
organización cromatínica por
sobre la acetilación
Se investigaron cambios globales
en la organización de la
cromatina de eritrocitos que
puedan explicar la remodelación
de los replicones
Pregunta…
¿¿¿Puede ocurrir lo contrario
cuando los núcleos de eritrocitos son
expuestos a extractos de huevo???
Es decir, ¿¿¿Puede haber una
transición desde sitios de unión
definidos a una asociación al azar
con la matriz nuclear???
El pasaje previo por la fase M
induce dos tipos de rearreglos en
nucleos de eritrocitos:
•Reduce el tamano de los loops,
consistentemente con una mayor
densidad de sitios de anclaje a la
matriz nuclear
•Disminuye el espacio promedio
entre origenes de replicacion
Pregunta…
¿¿¿La reprogramación de los replicones
en núcleos de eritrocitos incubados en
extracto de huevos en fase M de
Xenopus se debe a la condensación de
los cromosomas dirigida por la
Topoisomerasa II o únicamente al
pasaje de la fase M a la S???
La reorganización de los
replicones no se debe a la
transición de la fase M a la S
+ICRF 193
ICRF 193
inhibidor de la Topoisomerasa II
previene la
condensación cromosómica
No es el pasaje de la Fase M a la S
la que aumenta la tasa de
replicación sino la condensación
cromosómica
Pregunta…
La organización cromosómica
dependiente de topoisomerasa II,
¿¿¿controla la eficiencia de
reclutamiento de ORC???
•Tasa replicativa depende de un
eficiente reclutamiento de factores
de iniciación de la replicación
•Reclutamiento en eritrocitos
incubados en extracto en fase M es
afectado por la remodelación
cromatínica dependiente de
topoisomerasaII
Se investigó si la misma
reorganización cromatínica ocurre
durante el desarrollo temprano “in
vivo”
Los datos sugieren que la rápida
replicación del DNA durante el
desarrollo temprano, involucra el uso de
muchos puntos de unión situados al azar
entre la cromatina y la matriz nuclear.
La entrada en mitosis restaura el
tamaño de los loops tanto de embriones
tempranos en fase post-replicativa como
de núcleos diferenciados
Modelus
De este trabajo puede deducirse
que….
• La mayor especificidad en los orígenes de
replicación observado en células
diferenciadas debe ocurrir entre el medio
y el final de la fase G1
• Para obtener una exitosa clonación deben
realizarse sucesivas transeferencias
nucleares
Resumiendo…
• El aumento de la
organización de los cromosomas en la
metafa- tasa replicativa
se dirigida por la
depende de
Topoisomerasa II y el anclaje en la
Matriz Nuclear
loops más pequeños
reclutamiento de ORC = Mayor
orígenes de replicación
la acetilación de las histonas
• Es independiente de
la concentración de factores de
replicación
presencia del complejo prereplicativo
Gracias!!!!!
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