Mitotic Remodeling of the Replicon
and Chromosome Structure
Jean-Marc Lemaitre,1 Etienne Danis,1 Philippe Pasero,2 Yegor Vassetzky,1 and Marcel Me´
chali1,*
Remodelado mitótico del replicón
y la estructura cromosomal
Transferencia nuclear
Sin embargo…
• Baja eficiencia en experimentos de
clonación.
• Dificultades relacionadas con la
reprogramación del núcleo adulto
necesarias para los eventos del desarrollo
temprano
Repaso
En la transferencia nuclear
¿Qué factores controlan la capacidad
del núcleo adulto de participar en
eventos del desarrollo temprano?
Resultados
Incubación en extracto mitótico
La reprogramación del núcleo diferenciado para la
replicación del DNA requiere la incubación
con un extracto mitótico
extracto
Ensayo de espaciamiento
nucleosomal
cromatina
Peinado molecular
El pasaje por el extracto de fase M disminuye
la distancia entre orígenes de replicación
Niveles de acetilación
CTPB
Tricostatina
HAT
FORMAS ACETILADAS
FORMAS DESACETILADAS
HDACs
AA
Niveles de acetilación
La acetilación no es
necesaria
La acetilación presente
en el DNA es suficiente
El nivel de acetilación
no modifica la eficiencia
de replicación del DNA
adulto
Bajos niveles de
acetilación inhiben la
replicación
Es posible revertir
la desacetilación
Si bien la acetilación
es necesaria, no
puede explicar la
diferencia que existe
en la eficiencia de
replicación
La acetilación de histonas no induce la remodelación del ADN del eritrocito
Reorganización de la cromatina
Randomización de los sitios de unión a la matriz nuclear luego de la incubación
con el extracto mitótico
Reorganización de la cromatina durante la mitosis
Disminución del tamaño del loop luego de la incubación
con extracto mitótico
Resumiendo…
El pasaje por el extracto mitótico:
• Aumenta el número de orígenes de replicación
• Disminuye el tamaño de los loops. Esto se corresponde
con un aumento del número de sitios de unión a la
matriz nuclear.
• La constitución de la cromatina del eritrocito se vuelve
similar a la del esperma ingresando a la fase S
El rol de la topoisomerasa II
La incubación de 45 minutos en el extracto
mitótico es indispensable para el
remodelado de la cromatina, no la
transición de M a S.
Este remodelado favorece una replicación
rápida del DNA.
La topoisomerasa II es indispensable en
el remodelado de la cromatina que ocurre
en la fase M.
Unión de ORC al DNA
La cantidad de ORC que se una a una determinada
cantidad de DNA depende de la fuente de cromatina
Control: ICRF193 no induce la salida de mitosis
Sin Calcio:
Mitosis
Con Calcio:
Salida de mitosis
División celular en el desarrollo temprano de
Xenopus
• Solapamiento de fases M y S, sin G1 y G2
• Cariómero: un cromosoma rodeado de membrana
nuclear. Se forman en la anafase tardìa y se fusionan en
la telofase.
• La fase S comienza con la formación de los cariómeros.
Remodelado de la cromatina en el desarrollo
temprano de Xenopus (¡¡in vivo!!)
Confirmación in vivo de la randomización de los sitios de
anclaje a la matriz nuclear.
Remodelado de la cromatina en el desarrollo
temprano de Xenopus
Se observa in vivo que el tamaño del loop disminuye en los cariómeoros
al pasar por mitosis
• Confirmación in vivo de la randomización de los sitios de
anclaje a la matriz nuclear
• Se observa in vivo que el tamaño del loop disminuye en
los cariómeoros al pasar por mitosis
El rearreglo de la cromatina ocurre en
cada ciclo celular durante el
desarrollo temprano de Xenopus
Remodelado de la cromatina
Considerando que la polimerasa elonga siempre a la misma velocidad:
A menor distancia entre orígenes de replicación  mayor densidad de orígenes de replicación
mayor velocidad de replicación
Remodelado de la cromatina
El tamaño del loop aumenta gradualmente durante la fase S y luego disminuye
al ingresar en la fase M, debido a la actividad de la topoisomerasa II
Discusión
Modelo de la reorganización de la cromatina en cada ciclo
celular en el desarrollo de Xenopus
Mayor cantidad de sitios de anclaje
a la matriz nuclear (scaffold)
Disminución del tamaño de los loops
Disminución de la distancia entre
los orígenes de replicación
Randomización de los sitios
de anclaje al scaffold
La topoisomerasa II es responsable
para el remodelado
¿Cómo puede explicarse la baja eficiencia
de la transferencia nuclear?
Modelo del reloj citoplasmático
¿Qué ocurre en la fertilización?
Ambos pronúcleos remodelados para una rápida replicación
Transferencia nuclear: mejorando la
eficiencia…
•Exposición previa a
extracto mitótico
•Incubación de dos horas entre
la inyección del núcleo y la
activación del ovocito
Disparadores
• Interacción entre la matriz, el DNA y ORC para
el inicio de la replicación
• ¿Qué ocurre en mamíferos durante el
desarrollo? ¿Y con respecto a la transferencia
nuclear?
• ¿Qué pasa durante la mitosis de células adultas
con diferentes tasas de replicación?
• Distribución en el tamaño de los loops
• Diferencias entre extractos mitóticos
• Transferencia nuclear post-paper: ¿modificación
de protocolos?
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Mitotic Remodeling of the Replicon and Chromosome