Tema 16
INHIBICIÓN ENZIMÁTICA II
1. Inhibición pseudoirreversibles
2. Inhibición irreversible
2.1 Inhibidores irreversibles o venenos catalíticos
2.2 Análisis de la velocidad de inactivación
enzimática
2.3. Tipos de mecanismos de inhibición irreversible
1.-Inhibición irreversible simple.
2. Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato.
3.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente
4.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de Sustrato.
1. Inhibición Pseudoirreversible
Inhibidores
[I] no es >>> [E]
Inhiben a concentraciones parecidas a la enzima
Ki <<<<< Ki de Inhibidores reversibles
Orden 10-12 a 10-14 Unión fuerte a los enzimas
Pseudoirreversible el equilibrio está completamente desplazado
hacia la formación del complejo [EI]
[EI] no es despreciable
E +I
Io= I + EI
EI
a razón de velocidades máximas en
Eo=E + EI
presencia y ausencia de inhibidor
a
vi
vo

kcatE
kcatE

0
E
E0
E  aE
0
E  aE
EI = Eo – E
0
EI = Eo – aEo
Io= I + EI
EI = Eo (1-a)
Eo=E + EI
I  Ki
EI
E
Io  Ki
Eo (1  a )
 Eo (1  a )  Ki
aEo
(1  a )
a
Dividiendo los dos miembros por (1-a)
Io
(1  a )

1
a
Ki  Eo
 Eo (1  a )
Io
(1  a )
m=Ki
a
Eo  Ki  Io 
( Ki  Io  Eo )  4 E 0 Ki
2
2 Eo
Eo
a valores experimentales
1/a
Representación de Willian y Morrison: Inhibición pseudoirreversible
Io=0
vo
Io=1,5nM
Io=3,0 nM
Io=4,5nM
1,5
3,0
4,5
Eo nM
Inhibidor titula a la enzima
2. Inhibidores irreversibles
2.1 Venenos Catalíticos
Inhibidor irreversible une a la enzima por un proceso irreversible*
(constante de disociación 10-9 mol l-1)
Inhibidores se unen por enlaces covalentes a centro activo de la enzima
Inhibición suele ser progresiva. Depende del tiempo
* Los inhibidores irreversibles o venenos catalíticos son sustancias que se
unen a la enzima de manera tal que reducen su actividad prácticamente a cero.
- Esto es de particular importancia en los procesos de purificación de enzimas:
* Muchas enzimas son “envenenadas” por trazas de metales pesados, y por
esta razón, es una práctica común utilizar sustancias complejantes, p. ej.,
EDTA, en los tampones de ensayo, para secuestrar estos metales pesados.
-La aspirina inhibe la formación de Protaglandina-G2,
gracias a la metilación de la subunidad o dominio
responsable de la actividad ciclooxigenasa, de la
Prostaglandina-H-sintetasa.
Penicilina
La enzima modificada por la penicilina no puede unir el
puente de poli-Gly
2.2. Análisis de la velocidad de la inhibición irreversible
E +I
EI* Se forma este complejo que es inactivo
Cinética
[I]>>>[E]
El I esta en exceso no cambia durante la inhibición
[I] =[Io]
La cinética de la inhibición irreversible puede ser modelada
usando un modelo de primer orden de la forma
[EI]* mM
[EI]*=[ET] (1-exp-k`T)
K`(s-1) tendrá un significado diferente dependiendo del
mecanismo exacto de inhibición
Tiempo (s)
2.3. Tipos de mecanismos de inhibición irreversible
1.-Inhibición irreversible simple.
E+I
EI*
2.-Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato.
E+I
EI*
E+S
ES
3.- IInhibición irreversible simple tiempo dependiente
E+I
EI
EI*
4.- Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de
Sustrato.
E+I
EI
E+S
ES
EI*
1.-Inhibición irreversible simple.
ki
E+I
EI*
Reacción de segundo orden
ki constante de inhibición de segundo orden (M-1 s-1)
Ecuación diferencial que describe la formación de complejo EI
d  EI * 
dt
 ki  I  E 
I =Io
 E T    E    EI * 
Ecuación diferencial de primer orden describe el cambio en la
concentración de [EI] en el tiempo
d  EI * 
dt
 ki  Io  E T  EI *   k ` E T  EI * 
k`=ki [Io]
Integración de la ecuación
EI *
d  EI * 
 E
o
T
 EI * 
t
 k ´ dt
0
EI *  E T (1  exp
 k `t
)
[EI]* mM
k`=ki [Io]
Calcula k`
ki 
k`
Io 
Se obtiene una constante de
inhibición de segundo orden
Tiempo (s)
2. Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato.
E+I
E+S
ki
Ks
EI*
ES
Substrato puede proteger a la enzima de
la inhibición irreversible
Ecuación diferencial que describe la formación de complejo EI*
d  EI * 
dt
 ki  I  E 
I = Io
 E S 
Km 
 ES 
 E T    E    EI *    ES 
d  EI * 
dt
d  EI * 
dt
 ki  Io 
Et
E  
Et
 EI * Km
Km  S
Sustituyendo y despejando
 EI * Km
Ks  S
 k ´ E T  EI * 
k ` 
kiKm
Km  S
Io 
[EI]* mM
Integración de la ecuación
EI *
d  EI * 
 E
o
T
 EI * 
t
 k ´ dt
Calcula k`
0
Tiempo (s)
EI *  E T (1  exp  k `t )
k ` 
kiKs
Ks  S
 Io 
k`(s-1)
Graficando k` frente a diferentes
concentraciones de Inhibidor
m
ki
S y Ks constantes se
pueden calcular
idenpendientemente
Io mM
kiKs
Ks  S
3.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente
E+I
Ki
EI
ki
EI*
Rápido equilibrio reversible entre E y el I seguida de una reacción lenta e
irreversible de inactivación
[EI]*
Ecuación diferencial que describe la formación de complejo EI*
d  EI * 
 ki  EI 
dt
 E  I 
Ki 
 EI 
 E T    E    EI *    EI 
d  EI * 
dt
d  EI * 
dt
 ki
 Et
 EI * 
Et  EI *
EI  
1  ki /  Io 
k ´
1  ki /  Io 
 k ` E T  EI * 
k `
ki
1  ki /  Io 
ki  Io 
Io   Ki

[EI]* mM
Integración de la ecuación
EI *
d  EI * 
 E
o
T
 EI * 
t
 k ´ dt
EI *  E T (1  exp
Calcula k`
0
 k `t
)
Graficando k` frente a diferentes
concentraciones de Inhibidor
k `
ki  Io 
Io   Ki
k`(s-1)
Hipérbola rectangular
Ki y ki Procedimientos de
regresión no linear
Io mM
4.-Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en
presencia de Sustrato.
Ki
ki
E+I
d  EI * 
dt
 ki  EI
E+S

 E  I 
Ki 
 EI 
 E S 
Ks 
 ES 
 E T    E    EI *    EI   ES 
d  EI * 
dt
d  EI * 
dt

 Et
 EI * 
S  
Ki 
1
1 

 Io   Ks 
 k ` E T  EI * 
EI
Ks
EI*
ES
EI  
Et
 EI * 
S  
Ki 
1
1 

Io   Ks 
Sustituyendo y despejando
k ´
ki
S  
Ki 
1
1 

Io   Ks 
[EI]* mM
Integración de la ecuación
EI *
d  EI * 
 E
o
T
 EI * 
t
 k ´ dt
EI *  E T (1  exp
Calcula k`
0
 k `t
)
Graficando k` frente a diferentes
concentraciones de Inhibidor
k ´
ki
S  
Ki 
1
1 

Io   Ks 
k`(s-1)
Hipérbola rectangular
Ki y ki Procedimientos de
regresión no linear
Io mM
Como distinguirías entre una Inhibición
irreversible tiempo dependiente y otra Inhibición
irreversible tiempo independiente
k`(s-1)
Io mM
k`(s-1)
Io mM
RESUMEN
● Existen unos inhibidores denominados pseudoirreversibles que no cumplen todas las
condiciones de Michaelis, puesto que la concentración inicial de inhibidor [Io] es efectiva
al mismo orden de magnitud que la concentración inicial de enzima.
En este tipo de inhibición la Ki presenta valores que van desde 10-8 -10-12.
Se comportan como inhibidores pseudoirreversibles la gran mayoria de inhidores de
naturaleza proteica, así como los anticuerpos obtenidos frente a las proteínas enzimáticas.
El comportamiento cinético es diferente de los inhibidores reversibles.
● Los inhibidores suicidas son compuestos que son inactivos como inhibidores en
ausencia de enzimas, se activan específicamente por la enzima a la que van a inhibir ,
uniéndose covalentemente a la proteína enzimática.
● Análisis de la velocidad de la inhibición irreversible. Muestra un comportamiento
dependiente de la presencia de substrato y de la posibilidad que el parámetro tiempo
influya en el proceso de unión covalente. Así se distinguen desde el punto de vista
cinético:
Inhibición irreversible simple
Inhibición irreversible simple en presencia de Sustrato.
Inhibición irreversible simple tiempo dependiente
Inhibición irreversible simple tiempo dependiente en presencia de Sustrato
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Inhibición irreversible simple tiempo dependiente