CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
OBJETIVOS
• a) Conocer la técnica de cromatografía en capa
fina, c.c.f., sus características y los factores que en
ella intervienen.
• b) Calcular valores de r.f. de varias sustancias y
correlacionarlo a la selección adecuada del
eluyente y deducir la relación que existe entre la
polaridad de las sustancias que se analizan y la de
los eluyentes utilizados.
• c) Aplicar la técnica de c.c.f. como criterio de
pureza e identificación de sustancias.
ANTECEDENTES
• a) Concepto de cromatografía. Tipos de
cromatografía. Cromatografía de adsorción y
cromatografía de partición. Ejemplos.
• b) La cromatografía en capa fina. Sus
características y aplicaciones.
• c) Eluyentes, soportes y reveladores más
comunes para cromatografía en capa fina.
• d) Factores que influyen en una separación
por cromatografía de capa fina.
CONCEPTO DE CROMATOGRAFÍA.
• La cromatografía se define como la separación de una mezcla de dos o
mas compuestos por distribución entre dos fases, una de las cuales es
estacionaria y la otra una fase móvil. Varios tipos de cromatografía son
posibles, dependiendo de la naturaleza de las dos fases involucradas:
sólido-liquido (capa fina, papel o columna), liquido-liquido y gases-liquido
( fase vapor ).
• Todas las técnicas cromatográficas dependen de la distribución de los
componentes de la mezcla entre dos fases inmiscibles: una fase móvil,
llamada también activa, que transporta las sustancias que se separan y
que progresa en relación con la otra, denominada fase estacionaria. La
fase móvil puede ser un líquido o un gas y la estacionaria puede ser un
sólido o un líquido.
• Todos los sólidos finamente pulverizados tienen el poder de adsorber en
mayor o menor grado otras sustancias sobre su superficie; y, similarmente,
todas las sustancias pueden ser adsorbidas, unas con más facilidad que
otras. Este fenómeno de adsorción selectiva es el principio fundamental
de la cromatografía.
CONCEPTO DE R.F.
• Rf es el registro y se define como:
• Rf = distancia que recorre la muestra desde el
punto de aplicación / distancia que recorre el
disolvente hasta el frente del eluyente
• El valor de Rf depende de las condiciones en las
cuales se corre la muestra (tipo de adsorbente,
eluyente, así como las condiciones de la placa,
temperatura, vapor de saturación, etc.). Tiene
una reproducibilidad de ± 20%, por lo que es
mejor correr duplicados de la misma placa.
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.
• En este caso se utiliza una placa recubierta con fase
estacionaria manteniendo un pequeño espesor constante a
lo largo de la placa. El eluyente ascenderá, por capilaridad,
por la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta
produciendo “manchas” de los componentes.
• Se usan láminas de: vidrio como soporte del adsorbente,
plástico (ej: acetato) ó metálicos (ej: aluminio). Los
tamaños de la placa para CCf convencional son: 20 x 20; 10
x 20 y 5 x 2.
• Hay placas que contienen un indicador de fluorescencia,
para facilitar la identificación de las muestras. Si no se usa
indicador y los componentes no son coloridos se requerirán
técnicas de revelado.
Eluyentes más comunes para cromatografía en
capa fina.
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éter de petróleo
-tolueno
-dietil-éter, t-butil-éter
-diclorometano
-acetato de etilo
-n-pentano, n-hexano
-ciclohexano
-tetracloruro de carbono
-éter dietílico
-cloroformo
-acetona
-iso-propanol
-etanol
-metanol
-ácido acético
REVELADORES MÁS COMUNES PARA
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente
visibles; las incoloras puedenrevelarse mediante:
• Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede
usar una fase estacionaria impregnada con un
indicador fluorescente (F254 ó F366), el número que
aparece como subíndice nos indica la longitud de onda
de excitación del indicador utilizado.
• La introducción de la placa en vapores de yodo.
• El rocío con una solución de agua/H2SO4 1:1 (dentro de
un compartimiento especialmente protegido y bajo
una campana de extracción de gases).
• Después calentar
ADSORBENTES MÁS COMUNES PARA
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.
a) Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)
b) Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica)
c) Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
d) Poliamidas
Para la selección del adsorbentes deber tomar las
siguientes consideraciones:
a) Polaridad
b) Tamaño de partícula
a. Diámetro
b. Área Superficial
c) Homogeneidad
FACTORES QUE INFLUYEN EN UNA SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE
CAPA FINA.
a) Temperatura: a menor temperatura las sustancias se
adsorben más en la fase estacionaria.
b) La cromatografía debe llevarse a cabo en un área sin
corrientes de aire.
c) Limpieza de las placas. Muchas placas están
contaminadas con grasa o agentes plastificantes o
adhesivos. Para el trabajo a pequeña escala, éstas
deben limpiarse corriendo primero una mezcla de
cloroformo y metanol y después dejar secar
completamente antes de aplicar la muestra.
d) Pureza de los disolventes.
MATERIAL POR ALUMNO
SUSTANCIAS Y REACTIVOS
EXPERIMENTO 1: POLARIDAD DE LAS SUSTANCIAS.
Es un experimento comparativo en el que se desea saber cuál
sustancia es más polar y cuál menos polar. Para ello se le
proporcionará a usted las soluciones 1 y 2. Prepare 3
cromatoplacas (Nota 1) y aplique estas soluciones en cada
una de ellas (Nota 2), de tal manera que queden como se
indica en la siguiente figura:
• Eluya la primera cromatoplaca con hexano, la segunda con ACOEt y
la tercera con MeOH.
• En cada caso, una vez que se ha eluído cada placa, sacar de la
cámara de elución y dejar evaporar el eluyente para posteriormente
revelar con luz ultravioleta y posteriormente con yodo, observe y
anote sus resultados (Nota 3), luego revele con yodo, observe
nuevamente (Nota 4).
• Con base en los resultados obtenidos, conteste:
• a) ¿Cuál es el eluyente adecuado? ¿por qué?
• b) ¿Cuál es la sustancia más polar (solución 1 ó 2)? ¿por qué?
• c) ¿Cuál es la sustancia menos polar (solución 1 ó 2)? ¿por qué?
EXPERIMENTO 2: PUREZA DE LAS SUSTANCIAS.
• Se desea saber cuál sustancia es pura y cuál es
impura. Para ello se le proporcionará a usted las
soluciones 3 y 4.
• Prepare una cromatoplaca y aplique en ella
ambas soluciones por separado, como en el
• experimento anterior. Eluya entonces con AcOEt.
Revele con luz U.V. y posteriormente
• con yodo. Anote sus observaciones. Conteste:
• ¿Cuál es la sustancia pura (solución 3 ó 4)? , ¿cuál
es la impura? , ¿Cuál es el Rf de cada
componente?
EXPERIMENTO 3: INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN.
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•
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Se desea saber cuál es el efecto de la concentración de una sustancia en c.c.f. Para
ello se le proporcionará a usted la solución 5.
Prepare una cromatoplaca y en ella haga 3 aplicaciones de esta solución en orden
creciente de concentración como se indica en la siguiente figura:
Eluya entonces con AcOEt. Revele con luz U.V y. posteriormente con yodo. En cada
caso observe la intensidad de la coloración de las manchas.
¿Cuál es la relación que existe entre la intensidad de la coloración de las manchas
y la concentración de la sustancia, en cada caso?
EXPERIMENTO 4: LA C.C.F. COMO CRITERIO PARCIAL
DE IDENTIFICACIÓN
• 1. Se desea identificar los componentes de una mezcla, por
medio de su comportamiento c.c.f. y comparándolo con el de
sus sustancias testigo bajo las mismas condiciones
experimentales.
• Para ésto, se le proporcionará a usted las soluciones 6A y 6B,
(Nota 5).
• Prepare dos cromatoplacas y en ambas haga las siguientes
aplicaciones:
Luego eluya una de las cromatoplacas con AcOEt
revelando con luz U.V. y después con yodo. Anote sus
observaciones..
La otra cromatoplaca elúyala varias veces (4 por lo
menos) con un eluyente menos polar, por ejemplo una
mezcla de hexano-AcOEt (4:1), dejando secar la placa
entre una elución y otra. Observe la placa a la luz U.V.
después de cada elución. Si después de la cuarta
elución la mezcla no se separa, siga eluyendo hasta la
separación.
Finalmente revele con yodo. Anote sus observaciones.
2. Se desea identificar el principio activo de un medicamento comercial, por
medio de su comportamiento en c.c.f., comparándolo con un estándar
bajo las mismas condiciones experimentales. Para esto, se le
proporcionará una muestra problema de de un analgésico comercial, el
cual se identificará por comparación con las siguientes soluciones
estándar: A (ácido acetilsalicílico), B (cafeina) y C (acetaminofen) (Nota 5).
Prepare dos cromatoplacas, aplique los estándares de dos en dos y eluya con
hexano, con ACOEt y con hexano-AcOEt (1:3) y revele con luz U.V. o con
yodo.
Calcule el Rf de cada una de ellas, y seleccione el eluyente ideal
• Prepare tres cromatoplacas, aplique cada estándar y su muestra
problema, como se muestra:
• Eluya cada placa con el eluyente ideal y revele con luz U.V. y
posteriormente con yodo.
• Anote sus observaciones.
• Finalmente identifique que compuesto contiene el producto comercial
que se leproporciono.
Notas:
1) Para preparar las cromatoplacas se introducen dos portaobjetos juntos, limpios y
secos, en una suspensión de gel de sílice al 35% en AcOEt.
Para mayor facilidad se pueden usar cromatofolios comerciales.
2) Para aplicar las soluciones a las cromatoplacas utilice capilares, que previamente
deber ser estirados en la flama del mechero con el fin de que tengan el diámetro
adecuado. Ver figura.
3) Precaución, nunca mire directamente la luz ultravioleta, ésta puede causar daños
severos al ojo. Una vez revelada la placa, marque ligeramente con un lápiz el
contorno de las manchas para mejor ubicación de las mismas.
4) Para mayor claridad de los resultados, incluya en su informe los dibujos de las
cromatoplacas de todos los experimentos de esta práctica. Hágala del mismo
tamaño de las placas.
5) En este caso son soluciones estándar de productos puros.
•
MANEJO DE RESIDUOS
D1 a D5: Guardar los disolventes para recuperarlos por
destilación
D6: Empacar cuidadosamente para incineración.
D7: Se puede recuperar para su reuso, previo lavado y secado
CUESTIONARIO
a) En el experimento 1, ¿cuál de las dos sustancias, la más polar o la menos polar, recorre mayor distancia en la placa a partir del
punto de aplicación? ¿Porqué?
b) En ese mismo experimento, calcular los valores r.f. y contestar ¿cuál de las dos sustancias tiene r.f. mayor y cuál menor?
Frasco de elución Revelado con luz UV
Placa
Papel filtro
Punto de aplicación
Disolvente
Frente del eluyente
c) ¿Qué significa que una sustancia tenga:
a) rf < 0.5 ?
b) rf = 0.5 ?
c) rf > 0.5 ?
d) En el experimento 4, ¿cuál de las dos formas de elución permitió mayor separación de la mezcla?, ¿a qué se debe esto?
e) ¿Porqué la c.c.f. es un criterio parcial y no total de identificación?
F) ¿Cuál será el resultado de los siguientes errores en cromatografía en capa fina?
a) Aplicación de solución muy concentrada.
b) Utilizar eluyente de alta polaridad.
c) Emplear gran cantidad de eluyente en la cámara de cromatografía.
g) Una serie de colorantes es separada por cromatografía en capa fina. Calcular los valores de Rf de cada colorante de acuerdo a la
siguiente tabla.
Colorantes Distancia Recorrida (mm)
Eluyente 66.0
Rojo de metilo 56.0
Rodamina B 38.0
Rojo Congo 0.5
h) ¿Qué tratamiento es necesario darle a la alumina para reutilizarla?
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