BIOLOGIA MOLECULAR EN
MEDICINA




ELECTROFORESIS
HIBRIDIZACION MOLECULAR:
ADN (SOUTHERN), ARN (NORTHERN)
WESTERN
SECUENCIACION DE ADN
Dra. Liliana N. Guerra
ELECTROFORESIS
TECNICA DE ELECTROFORESIS
SE SEPARAN MOLECULAS EN FUNCION DE:
SU CARGA Y PESO MOLECULAR
SE APLICA UN CAMPO ELECTRICO Y LAS MOLECULAS CARGADAS MIGRAN
HACIA UNO DE LOS POLOS
SE PREPARA UN GEL QUE ES UN ESQUELETO DE UNA SUSTANCIA
POLIMERICA (EJ: AGAROSA) QUE ESTA EMBEBIDO EN UN LIQUIDO QUE
PERMITE EL DESPLAZAMIENTO DEL ACIDO NUCLEICO
ANALOGIA: EL GEL ES COMO UNA ESPONJA A TRAVES DE LA CUAL PUEDE
PASAR LIQUIDO Y LO QUE ESTE DISUELTO EN EL LIQUIDO
ELECTROFORESIS

UNA MOLECULA CON CARGA NETA SE DESPLAZA EN
UN CAMPO ELECTRICO CON UNA VELOCIDAD
DEPENDIENTE DE:

1.- LA FUERZA DEL CAMPO (E)
2.- LA CARGA DE LA MOLECULA (Z)
3.- EL COEFICIENTE DE FRICCION (F)


F DEPENDE DE:
a) MASA Y FORMA DE LA MOLECULA QUE MIGRA
b) VISCOSIDAD DEL MEDIO
ELECTROFORESIS
POSIBLES MEDIOS SOPORTE PARA LA MIGRACION:




PAPEL
ACETATO DE CELULOSA
GEL DE POLIACRILAMIDA
GEL DE AGAROSA
VELOCIDAD DE MIGRACION:

V= dx = E µ
dt

MOVILIDAD = µ

CON Z FIJA µ SOLO DEPENDE DE F, DEPENDE DEL PESO MOLECULAR

DEPENDE DE Z Y F
<F>µ
< PESO MOLECULAR  > µ
ELECTROFORESIS
LA ELECTROFORESIS EN GEL DE
AGAROSA PERMITE SEPARAR,
IDENTIFICAR Y PURIFICAR
FRAGMENTOS DE ACIDO NUCLEICO
EL ADN TIENE CARGA NEGATIVA POR
SUS FOSFATOS
 EL ADN MIGRA HACIA EL POLO
POSITIVO


ELECTROFORESIS
ELECTROFORESIS


LA AGAROSA EN UN POLIMERO LINEAR COMPUESTO
POR GALACTOSA
EXITE RELACION LINEAR ENTRE EL LOG DE µ Y LA
CONCENTRACION DEL GEL
LOG µ = LOG µo – F T
T= CONCENTRACION DEL GEL
SEGÚN EL PORCENTAJE QUE SE USE PARA PREPARAR
EL GEL SE PODRAN SEPARAR FRAGMENTOS DE
DIFERENTE PESO MOLECULAR
ELECTROFORESIS
PORCENTAJE (PESO/VOLUMEN) Kb DE ADN
0.6%
1- 20
0.7%
0.8 – 10
1%
0.5 – 8
1.2%
0.4 – 6
1.4%
0.2 – 4
ELECTROFORESIS

RESUMEN:
LOS FRAGMENTOS DE ACIDO NUCLEICO
“CORREN” DE FORMA INVERSAMENTE
PROPORCIONAL AL LOGARITMO DE SU PESO
MOLECULAR

CUANTO MAS CHICOS = MAS CORREN

LA VELOCIDAD DE MIGRACION ES
PROPORCIONAL AL CAMPO APLICADO,
USANDOSE ENTRE 80 A 120 V
HIBRIDIZACION MOLECULAR

ES UNA REACCION EN LA CUAL UNA DE LAS
CADENAS DEL ACIDO NUCLEICO A ESTUDIAR SE
HIBRIDIZA (OCURRE “UNION”) A MOLECULAS
COMPLEMENTARIAS

ESTA HIBRIDIZACION DEPENDE DE LA
TEMPERATURA DE MELTING (“FUSION”) DE LAS
MOLECULAS HIBRIDAS = Tm

EL Tm DE UNA DOBLE CADENA DE ACIDO
NUCLEICO SE DEFINE COMO LA TEMPERATURA A LA
CUAL EL 50% DE LAS DOBLES CADENAS ESTAN
DISOCIADAS COMO MOLECULAS SIMPLE CADENA
HIBRIDIZACION MOLECULAR
Tm DEPENDE DE:







1.- CONTENIDO DE GUANINA-CITOCINA (G-C)
2.- LARGO DE LA MOLECULA (PARES DE BASES = bp)
3.- CONCENTRACION PRESENTE DE CATIONES (M)
EJ: Na+
ESTIMACION DE Tm:
Tm = 81.5 + 16.6 log M + 0.41 (%G-C) – 500/No bp
ES IMPORTANTE EL CONTENIDO G-C, Y TAMBIEN SU
DISTRIBUCION
SI EXISTEN ZONAS DE NO COMPLEMENTARIDAD
(MISSMATCH) SE REDUCE LA Tm ESTIMADA:
1% MISMATCH: DISMINUYE 1.5 ◦C
HIBRIDIZACION MOLECULAR
SOUTHERN BLOTTING = HIBRIDIZACION DE ADN




SE REQUIERE :
LA DIGESTION DEL ADN CON ENZIMAS DE RESTRICCION,
LA SEPARACION POR ELECTROFORESIS,
LA TRANSFERENCIA A UNA MEMBRANA POR CAPILARIDAD DE LOS
FRAGMENTOS (SE UTILIZA UNA SOLUCION DE ALTA FUERZA IONICA
QUE FLUYE DESDE EL GEL HACIA LA MEMBRANA)
LA HIBRIDIZACION CON UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO
SEÑAL (PROBE = SONDA)

COMO ESTA TECNICA FUE DESARROLLADA POR PRIMERA VEZ POR
E. M. SOUTHERN
LAS TRANSFERENCIAS DE ESTE TIPO TOMARON SU NOMBRE

SE UTILIZA PARA ESTUDIAR LA ESTRUCTURA DE GENES DE INTERES
HIBRIDIZACION MOLECULAR
HIBRIDIZACION MOLECULAR

LA HIBRIDIZACION SE REALIZA GENERALMENTE A
LO QUE SE LLAMA BAJA ASTRINGENCIA (BAJA
EXIGENCIA):
25 ◦C POR DEBAJO DEL Tm
TODO LO QUE SE PUEDA UNIR HIBRIDIZA
RAPIDAMENTE, AUNQUE LA HOMOLOGIA SEA SOLO
PARCIAL
SE REQUIERE MAYOR EXIGENCIA PARA ASEGURAR
HIBRIDIZACION DE LO IGUAL
LA ASTRINGENCIA SE REALIZA CON POSTERIORIDAD,
DURANTE LOS LAVADOS DE LA HIBRIDIZACION.

HIBRIDIZACION MOLECULAR

EJEMPLO:
INACTIVACION DE GENES SUPRESORES
DE TUMOR POR REARREGLOS EN EL
ADN, MUTACIONES PUNTUALES O
DELECIONES ALELICAS PUEDE SER
DEMOSTRADA CON ESTA TECNICA
FILTROS
HIBRIDIZACION MOLECULAR
NORTHERN BLOTTING = HIBRIDIZACION DE ARN
SE UTILIZA PRINCIPALMENTE PARA DETECTAR:
1.- CAMBIOS EN LA EXPRESION DE GENES
 LA INTENSIDAD DE LA BANDA OBSERVADA PUEDE REPRESENTAR
EL NIVEL DE TRANSCRIPCION DEL GEN EN ESTUDIO EN LA
CELULA ORIGINAL
2.- CAMBIOS EN EL TAMAÑO DE LOS RNAm TRANSCRIPTOS
 SE PUEDE DETECTAR EXPRESION EXPECIFICA DE TEJIDO DE
TRANSCRIPTOS RAROS Y TRANSCRIPTOS TRUNCADOS
RESULTANTES DE MUTACIONES
ESTOS CAMBIOS PUEDEN ALTERAR LA PRODUCCION DE LA PROTEINA
O SU ACTIVIDAD
HIBRIDIZACION MOLECULAR
EN LA OBTENCION DEL ARN HAY QUE CUIDAR SU INTEGRIDAD
Y EVITAR SU POSIBLE DEGRADACION POR RNAsas.
 FUENTES DE CONTAMINACION:
MANOS DEL TECNICO Y BACTERIAS U HONGOS EN EL POLVO DEL
AMBIENTE.

PRECAUCIONES: USO DE GUANTES, AGUA AUTOCLAVADA, VIDRIO
AUTOCLAVADO, PLASTICO TRATADO CON UV.


LOS ARN NATIVOS CON ALTA ESTRUCTURA SECUNDARIA NO SE
UNEN EFICIENTEMENTE A LAS MEMBRANAS, ELLOS DEBEN
SER DESNATURALIZADOS Y LUEGO FRACCIONADOS POR
ELECTROFORESIS
SE REALIZAR TRATAMIENTO CON AGENTES QUE DESARMAN
SU ESTRUCTURA SECUNDARIA (FORMALDHEIDO)
HIBRIDIZACION MOLECULAR
NORTHERN BLOTTING = HIBRIDIZACION DE ARN


UNO DE LOS MEJORES EJEMPLOS ES LA MUTACION
DEL GENE DE RETINOBLASTOMA (Rb) LA CUAL
PUEDE IMPEDIR LA TRANSCRIPCION DEL GEN
NORMAL
SE PUEDEN REALIZAR NORTHERN DE ARN TOTAL O
SOLO ARNm
FILTROS
HIBRIDIZACION MOLECULAR
LAS MUESTRAS DE ADN O ARN TRANSFERIDAS DEBEN
PERMANECER FIJAS A LA MEMBRANA.
SE REALIZA UN “COCINADO” DE LA MEMBRANA A 80◦C , OCURRE
ENTRECRUZAMIENTO ENTRE EL FILTRO Y LAS MOLECULAS
QUE FUERON TRANSFERIDAS





DESPUES DE SER REVELADAS, LAS MEMBRANAS SON
GUARDADAS A 4◦C
SE PUEDE REMOVER EL PROBE ANTERIOR Y UTILIZARLAS
NUEVAMENTE
CON SDS SE SEPARAN LAS MOLECULAS HIBRIDIZADAS
(PRINCIPALMENTER PARA PROBES RADIOACTIVOS)
PARA PROBES BIOTINILADOS ES DIFICIL
WESTERN BLOTTING





ES UNA TECNICA DE “HIBRIDIZACION” DE
PROTEINA – PROTEINA:
SE REALIZA LA INMUNODETECCION DE UN
ANTIGENO ESPECIFICO DE INTERES EN UNA
MEZCLA COMPLEJA DE PROTEINAS
PRIMERO SE SEPARA LA MEZCLA DE PROTEINAS DE
ACUERDO A SU PESO MOLECULAR USANDO
ELECTROFORESIS
LAS PROTEINAS SEPARADAS SON INMOBILIZADAS
SOBRE LA MEMBRANA DE NITROCELULOSA
SE IDENTIFICA LA BANDA PROTEICA DE INTERES
USANDO UN ANTICUERPO ESPECIFICO
WESTERN BLOTTING
SDS-PAGE
PAGE= POLY ACRILAMIDE GEL ELECTROFORESIS
 SDS= SODIUM DODECYL SULFATE:
DETERGENTE ANIONICO QUE DESNATURALIZA LAS
PROTEINAS Y LAS CARGA NEGATIVAMENTE


LA ACCION DEL SDS PROVOCA QUE TODAS LAS
PROTEINAS QUEDEN CON LA MISMA DENSIDAD DE
CARGA POR UNIDAD DE LARGO
LAS PROTEINAS MIGRAN SOLAMENTE EN FUNCION DE
SU PESO MOLECULAR
WESTERN BLOTTING

LOS AMINOACIDOS SON ANFOTERICOS: PUEDEN SER
ANIONES O CATIONES DEPENDIENDO DEL PH A
QUE SE ENCUENTREN

DEPENDE DEL PUNTO ISOELECTRICO = PH EN QUE
LA CARGA NETA ES CERO

PH> PUNTO ISOELECTRICO  SON ANIONES
PH< PUNTO ISOELECTRICO  SON CATIONES

LA MIGRACION DE LA PROTEINA DEPENDE DEL PH DE
LA SOLUCION EN QUE SE ENCUENTRA
WESTERN BLOTTING
WESTERN BLOTTING

EXITE UNA RELACION LINEAR ENTRE EL LOG DE PESO MOLECULAR Y
LA DISTANCIA DE RECORRIDO DE LA PROTEINA EN EL GEL

Rf= MOVILIDAD RELATIVA =


MIGRACION DE LA PROTEINA
MIGRACION DEL COLORANTE
INDICADOR DEL FRENTE
Log PM
Rf
WESTERN BLOTTING
DETECCION

EL COMPLEJO ANTIGENO – ANTICUERPO ES
DETECTADO POR EL USO DE UN SEGUNDO
ANTICUERPO UNIDO A UNA ENZIMA QUE
RECONOCE UN SUBSTRATO Y DA COLOR
ALTERNATIVAS PARA LA DETECCION:


USAR PROTEINA A UNIDA A 125Iodo QUE RECONOCE
EL ANTICUERPO ESPECIFICO
USAR UN SEGUNDO ANTICUERPO UNIDO A UNA
MARCA QUIMIOLUMINISCENTE
SECUENCIACION ADN
SECUENCIACION ADN
SE PUEDE SECUENCIAR FRAGMENTOS DE ADN HASTA
CON 500 BASES DE FORMA QUIMICA:
 METODO DE CLIVADO DE MAXAM-GILBERT
 METODO DE TERMINACION DE LA CADENA DE
SANGER


AMBAS TECNICAS ESTAN BASADA EN 4 MEZCLAS DE
REACCIONES, EN LAS CUALES EL FRAGMENTO DE
ADN FINALIZA EN UNA BASE ESPECIFICA (ADENINA,
CITOSINA, GUANINA O TIMINA).
LOS FRAGMENTOS SON ANALIZADOS POR
ELECTROFORESIS
SECUENCIACION ADN : MAXAM - GILBERT
SECUENCIACION ADN: SANGER
TERMINACION DE LAS CADENAS POR
DIDEOXINUCLEOTIDOS

UN PRIMER DE NUCLEOTIDOS SINTETIZADO
HIBIRIDIZA CON EL EXTREMO 3’ DEL “TEMPLADO”
DE ADN QUE SERA SECUENCIADO

SE AGREGA ADN POLIMERASA QUE CATALIZA IN
VITRO LA SINTESIS (5’  3’) DE UNA NUEVA
CADENA DE ADN QUE ES COMPLEMENTARIA AL
TEMPLADO

SE UTILIZAN LOS 4 d NTP Y 1 dd NTP, CUANDO
ESTE dd NTP ES INCORPORADO, LA REACCION DE
SINTESIS TERMINA
SECUENCIACION ADN




LOS dd NTP NO TIENEN EL 3’ OH QUE SE
REQUIERE PARA LA ELONGACION DE LA
CADENA DE ADN
SE GENERA UNA POBLACION DE CADENAS
DE ADN DE DIFERENTES TAMAÑOS QUE SE
PUEDEN ANALIZAR
CADA UNA DE ELLAS TERMINA EN EL dd NTP
SE REALIZAN 4 REACCIONES SEPARADAS
PARA CADA NUCLEOTIDO Y SE PUEDE
“LEER” LA SECUENCIA DE ADN
SECUENCIACION ADN
SECUENCIACION ADN
ADN TEMPLADO:



LA PUREZA E INTEGRIDAD DEL ADN ES
FUNDAMENTAL
SE PUEDE SECUENCIAR HASTA 500 BASES
PARA UNA BUENA SEPARACION DE LAS
BANDAS EN EL GEL EL ADN DEBE ESTAR
TOTALMENTE DESNATURALIZADO (EVITA
COMPRESIONES)
ACTUALMENTE SE
REALIZA LA
SECUENCIACION
AUTOMATICA
USANDO PCR
COMBINADA CON
SANGER
SECUENCIACION ADN
FILIACION
VARIABILIDAD GENETICA DE LA ESPECIE HUMANA
POLIMORFISMO GENETICO EN LA POBLACION
LOS POLIMORFISMOS SON DIFERENTES FORMAS DEL MISMO ALELO
EN LA POBLACION
LA FRECUENCIA DE LOS ALELOS RAROS DEBEN AL MENOS SER DEL
0.01 PARA SER CONSIDERADAS POLIMORFISMOS Y NO UNA
MUTACION RECURRENTE
LOS ALELOS DEL GRUPO DE SANGRE ABO SON EJEMPLOS
GENETICOS DE POLIMORFISMO
FILIACION
EL TERMINO POLIMORFISMO HA SIDO DEFINIDO POR VOGEL
EN 1986
COMO EL RASGO MENDELIANO QUE EXISTE EN LA POBLACION
EN POR LO MENOS DOS FENOTIPOS,
NINGUNO DE LOS CUALES OCURRE CON UNA FRECUENCIA
MENOR AL 1%
SE HEREDA COMO UN RASGO MENDELIANO
FILIACION
1 INDIVIDUO: 2 ALELOS POR GEN
POBLACION: HAY POLIMORFISMO PARA LOS ALELOS
EN LA POBLACION LOS INDIVIUOS PUEDEN PRESENTAR DIFERENTES
POLIMORFISMO QUE DAN LUGAR A DIFERENTES FENOTIPOS
EN LA POBLACION EXISTE UN ELEVADO NUMERO DE GENES QUE
PRESENTAN POLIMORFISMO = QUE TIENEN GRAN NUMERO DE
DISTINTOS ALELOS = QUE TIENEN ALELOS CON DISTINTA SECUENCIA
DE NUCLEOTIDOS
FILIACION
EL GENOMA HUMANO CONTIENE 3,2 x 109 PARES DE BASES (ADN)
EL 10% REPRESENTA UN TOTAL DE APROXIMADAMENTE 70.000
GENES
EL RESTO DEL ADN SON SECUENCIAS NO GENICAS QUE:
MANTIENEN LA ESCTRUCTURA DEL ADN,
SON REGULATORIAS (PERMITEN LA TRANSCRIPCION),
SON SECUENCIAS REPETIDAS
FILIACION
SECUENCIAS REPETIDAS
ALGUNAS DE ELLAS SON REPETICIONES DE 2 NUCLEOTIDOS:
(CA)n --- (GT)n
(CT)n --- (GA)n
SE LLAMAN MICROSATELITES DE DINUCLEOTIDOS
ELLAS PRESENTAN POLIMORFISMO PARA n EN DIFERENTES
INDIVIDUOS,
PUEDEN SER UTILIZADAS COMO MARCADORES GENETICOS
FILIACION
SECUENCIACION ADN
EN 1980 SE SUGIERE LA POSIBILIDAD DE CONSTRUIR UN MAPA
GENETICO USANDO MARCADORES DINUCLEOTIDOS
EL PRIMER MAPA FUE BASADO EN 403 LOCUS POLIMORFICOS A
PARTIR DE 21 FAMILIAS DE LAS CUALES SE TENIA
INFORMACION DE TRES GENERACIONES
EL PRIMER CROMOSOMA MAPEADO DE ESTA FORMA FUE EL X
FILIACION
ESTUDIOS DE FILIACION
SE ANALIZA EL PATRON DE 4 A 5 MARCADORES
MICROSATELITES DINUCLEOTIDOS POR INDIVIDUO
SE UTILIZA UNA TECNICA QUE PERMITE VISUALIZAR EL
SEGMENTO DE ADN QUE TIENE ESTOS MARCADORES
PARA EL ESTUDIO DE PATERNIDAD SE DEBE TOMAR LA MUESTRA DE LA
MADRE, HIJO Y POSIBLE PADRE
SE REALIZA LA TECNICA DE PCR PARA EL LOCUS D1S80 (marcador
microsatélite Dinucleotido del cromosoma 1 Satelite No 80)
CROMOSOMA 1
----------------7 REPETICIONES
PCR
PARA EL MARCADOR



CROMOSOMA 1
------------------------------3 REPETICIONES
PCR
PARA EL MARCADOR



CADA UNO ES UN ALELO DIFERENTE ENTRE INDIVIDUOS
FILIACION
LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS PARA EL LOCUS D1S80 VAN DE 375
PARES DE BASE A 850 PARES DE BASES.
ESTA DIFERENCIA DE TAMAÑO SE PUEDE VER EN LA
ELECTROFORESIS Y ASIGNAR LOS ALELOS PARA CADA INDIVIDUO
DIRECTAMENTE
EL TRABAJO SE REALIZA EN DOS DIAS:
DIA 1: SE OBTIENEN LAS MUESTRAS Y SE REALIZA LA TECNICA PCR
DIA 2: SE REALIZA LA ELECTROFORESIS Y SE VISUALIZA EL
RESULTADO
SE VISUALIZA POR ELECTROFORESIS
FILIACION
FILIACION
CADA ALELO (CADA POLIMORFISMO) PARA EL LOCUS D1S80 PRESENTA UNA
FRECUENCIA POBLACIONAL
ES IMPORTANTE CONFIRMAR LA FRECUENCIA DEL ALELO
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1a CLASE HIBRIDIZACIONES Y SECUENCIACION