1065. Inmunología Aplicada
Enseñanza Experimental
Estimulación de Linfocitos
y Cultivo Celular
Dra. Ana Esther Aguilar Cárdenas
Laboratorio de Investigación en Inmunología
Material
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1 estuche de disección
6 agujas hipodérmicas
2 vasos de precipitado de 150 mL
1 tubo de cultivo estéril de 15 mL
1 micropipeta (200-1000 mL)
1 micropipeta (20-200 mL)
1 micropipeta (2-20 mL)
Puntas para micropipetas estériles
1 piseta
1 gradilla
1 tubo para microcentrífuga estéril
1 microplaca para cultivo con 24 pozos
1 cámara de Neubauer
Dra. Ana Esther Aguilar Cárdenas
Laboratorio de Investigación en Inmunología
Material
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1 jeringa estéril de 5 mL
1 caja Petri estéril
3 pipetas estériles de 5 mL
2 tubos de 13x100 estériles con tapón de gasa
10 gasas estériles
NOTA. Material por equipo.
Dra. Ana Esther Aguilar Cárdenas
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Reactivos
• Medio RPMI sin suplementar
• Medio RPMI suplementado (piruvato,
estreptomicina/penicilina, suero fetal bovino,
aminoácidos no esenciales, glutamina)
• Etanol al 70%
• Azul tripano al 0.04%
• Concanavalina A en concentración óptima
• Éter etílico
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Material biológico
• 1 ratón de la cepa BALB/c de 25 días de edad
Dra. Ana Esther Aguilar Cárdenas
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Obtención de
células esplénicas
Anestesiar al ratón en
una cámara con éter
Obtener el bazo
quirúrgicamente y
colocarlo en la caja
Petri
Perfundir gota a gota
con 5 mL de medio
RPMI no suplementado
Resuspender el botón
celular en 5 mL de RPMI
suplementado
Centrifugar a 1500 rpm
durante 10 minutos
(lavar 2 veces en las
mismas condiciones)
Transferir la suspensión
celular al tubo de 15 mL
con tapón
Dra. Ana Esther Aguilar Cárdenas
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Cuenta de linfocitos
Realizar una dilución 1:20 de la
suspensión de linfocitos con
azul tripano en un tubo para
microcentrífuga
Tomar 10 mL de la dilución
anterior y llenar la cámara de
Neubauer
Realizar el conteo de linfocitos
viables en el microscopio a un
aumento de 40X
Ajustar la suspensión de
linfocitos con RPMI
suplementado a 106 cel/mL
Dra. Ana Esther Aguilar Cárdenas
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Cultivo celular
LINFOCITOS ESTIMULADOS
LINFOCITOS CONTROL
Llenar 3 pozos con 500 mL de la
suspensión de linfocitos
ajustada
Llenar 3 pozos con 500 mL de la
suspensión de linfocitos
ajustada
Adicionar 500 mL de
Concanavalina-A 2.5 mg/mL
Adicionar 500 mL de RPMI
suplementado
Incubar la microplaca a 37°C
con atmósfera de CO2 al 5%
durante 24 h
Revisar el cultivo en un
microscopio invertido con
contraste de fases
Dra. Ana Esther Aguilar Cárdenas
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Cultivo Celular