Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias. Universidad de Chile.
“ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN
GÉNICA DE PROTEÍNAS
DURANTE EL DESARROLLO
CITOPLASMÁTICO DEL
OVOCITO”
Asuncion Espinosa, Karen Espinoza, Yasna Espinoza, Alex
Finkelstein, Eduardo Flores, Alejandra Galindo, Ricardo
Gonzalez, Paula Gonzalez, Francisco Guevara, Carolina
Gutierrez, Eric Hernandez, Connie Kalwitz.
OVOGÉNESIS
• Proceso de diferenciación y formación
de gametos femeninos (óvulos).
• Desde el desarrollo fetal a la adultez.
• Meiosis: 4 células.
• Cambios citoplasmáticos del ovocito.
FOLICULOGÉNESIS
• Proceso de formación, crecimiento
y diferenciación de folículos.
• Folículo de Graff.
• Intervienen componentes celulares,
de la teca y de la granulosa.
PROTEÍNAS PARTICIPANTES
• Producen cambios fundamentales para
una adecuada fertilización.
• Sirven para determinar etapa de
maduración.
• Técnicas de marcaje
(Ej: Wester Blot o inmunohistoquímica)
FATORES INVOLUCRADOS
EN EL DESARROLLO
FOLICULAR TEMPRANO.
FACTOR
ORIGEN
FUNCIÓN
Figla o Fig
Ovocito
Coordinación de genes estructurales
que codifican la zona pelúcida
Ovocito
Diferenciación y proliferación celular
(granulosa)
Ovocito
Diferenciación y proliferación celular
(granulosa)
BMP15
(proteína
morfogenética del
hueso)
GDF 9 (factor
de crecimiento y
diferenciación)
Ovocito
Estimulación de mitosis y
diferenciación a células de la
granulosa
Células
pregranulosa
Promoción de la transición
folículo primordial-primario
Células
pregranulosa
Promoción de la transición
folículo primordial-primario
Insulina
Endocrino
Promoción de la transición
folículo primordial primario.
Estimulación de la
esteroidogénesis en células de
la granulosa y teca
AMH
Células de la
granulosa
Inhibición del desarrollo de los
folículos primordiales
bFGF
(factor de
crecimiento básico
de fibroblastos)
KL
(factor Kit)
LIF (factor
inhibidor de
leucemia)
(hormona antimülleriana)
AhR
(receptor de
dioxinas)
CTGF
(factor de
crecimiento
derivado de
tejido
conjuntivo)
Activina
KGF (factor
de
crecimiento
derivado de
queratinocito
s)
Células de la
granulosa
Regulación del tamaño de la
poza del ovocito
Células de la
granulosa
Mantenimiento del fenotipo
celular y reclutamiento de la
teca
Células de la
granulosa
Proliferación celular y
estimulación de la
esteroidogénesis (granulosa)
Células de la
teca
Proliferación celular y
crecimiento folicular
TRANSICIÓN DE FOLÍCULO
PRIMORDIAL A PRIMARIO.
TRANSICIÓN DE FOLÍCULO PRIMARIO A
SECUNDARIO.
TERMINO DE “ARRESTO
MEIOTICO”.
• cAMP: disminuyen sus niveles y se
produce desfosforilación de CDK1
(Thr14 y Thr15). Se activa MPF.
• MPF:
1. Ciclin B; casi indetectable, la mayoría
en el citoplasma como RNAm.
2. P34; en altos niveles, la mayoría en
citoplasma como proteína.
TERMINO DE “ARRESTO
MEIOTICO”.
• CDC25: desfosforila CDK1.
• WEE1/MYT1: fosforila CDK1.
• GPR3: aumenta los niveles de cAMP.
• RGS2: inhibe la producción de cAMP.
• Gi: inhibe adenil ciclasa, con lo que
disminuye el cAMP.
ENZIMAS EXPRESADAS DURANTE
LA MADURACIÓN DEL OVOCITO
Funciones
Glucosa 6 Fosfato
Deshidrogenasa (G6PD)
Método de marcaje
Prueba de tinción azul
de cresol brillante
(BCB)
Asociada a la producción de
energía
Explica la escasa
funcionalidad al término de
esta etapa
Incoloro
Resultados
¿Motivo?
Nos permite establecer
la madurez del ovocito
Azul
 BCB (-)
 BCB (+)
•
(A) The diameter excluding the zona pellucida (DEZ) of an oocyte was measured with cumulus cells; oocyte plasma membrane
was brought into the clearest focus under a phase contrast microscope and the DEZ was measured with a micrometer. (B) Four
groups of COCs were observed under a microscope after BCB staining: (a) those with a blue color in both the ooplasm and
cumulus cells, (b) those showing a blue color in neither ooplasm nor cumulus cells, (c) those with blue color in ooplasm but not
in cumulus cells and (d) those with blue color in cumulus cells but not in ooplasm (arrows). (C-E) Oocytes with fully polarized,
partially polarized and non-polarized patterns of mitochondrial distribution, respectively (refer to text for detailed description).
(F) After double staining, all the nuclei of cumulus cells were stained blue by Hoechst 33342, but only the nuclei of apoptotic
cells were stained red by PI and hence looked pink under the fluorescence microscope. (G) A merged picture after Annexin V
and PI staining, in which early apoptotic cumulus cells were stained exclusively by Annexin V (green), late apoptotic cells were
stained by both Annexin V and PI (red), while necrotic cells were labeled by PI, but were negative for Annexin V.
ENZIMAS EXPRESADAS DURANTE LA
MADURACIÓN DEL OVOCITO
• Glutatión
Reducido (GSH)
se ven
incrementados
los niveles de
GSH
Funciones
A medida que el
momento de la
ovulación se acerca
Inmunohistoquímic
a, Western Blot,etc
• Protección contra el daño
oxidativo
• Descondensación de la
cabeza del espermatozoide
• Rol importante en el
desarrollo embrionario in
vitro
Indicador de madurez gametogénica
PROTEÍNAS EXPRESADAS EN LA
MADURACIÓN DEL OVOCITO
Balance redox intracelular
Funciones
Peroxiredoxinas
Protección contra el
estrés oxidativo
Importancia en las etapas
finales de la maduración
Niveles extremadamente altos en
todas las etapas de la maduración
In vitro del ovocito del cerdo
Función Transición de la
Ubiquitin carboxyl
etapa de vesícula
hidrolasa isoenzima L1
germinal (VG) a
metafase II (MII) en el
(UBL1)
ovocito
Espermin sintetasa
(SPSY)
PROTEÍNAS EXPRESADAS EN
LA MADURACIÓN DEL
OVOCITO
Proteínas de
la vía
glicolítica
Cadena beta de
la mitocondria
Alfa enolasa
Triosafosfato
isomerasa
ATP sintetasa
Dihidropoamida
succinil transferasa
Galactoquinasa
Preparación para
la modificación del
metabolismo
energético luego
de la fecundación
DISCUSIÓN - CONCLUSIÓN
• Existe un constante interés de los factores
productivos, tanto en las ventajas como en las
desventajas.
• Gran importancia el estudio del desarrollo del
ovocito,
enfocados
en
los
factores
determinantes
de
su
maduración
y
fecundación .
• Falta información mas acabad e integral al
respecto.
• Métodos de marcaje bastante conocidos como
radioinmunohistoquimica o western blot nos
permiten realizar una identificación directa de
la enzima o proteína.
• También se hace necesario utilizar pruebas
específicas.
DISCUSIÓN - CONCLUSIÓN
• El objetivo es lograr tener
una mayor certeza de que el
ovocito está listo para ser
fecundado.
• No todas las sustancias
químicas, proteínas y
enzimas que se han
detectado actúan sobre el
ovocito directamente
• La mayoría de las proteínas
y enzimas detectadas
fluctúan a lo largo de las
etapas de maduración del
ovocito
• Variaciones significativas o
escasas de la concentración
de proteínas.
G6PD
DISCUSIÓN - CONCLUSIÓN
• Cabe destacar que las reacciones que se
producen no sólo dependen de los
niveles de una proteínas, hormonas y/o
enzimas en un determinado momento.
FIN
Descargar

proteínas expresadas en la maduración del ovocito