DETERMINACIÓN DE
PROTEÍNAS
A. LEY DE LAMBER Y BEER
B. CURVA PATRÓN
C. MÉTODO UV: ABS 280NM
D. MÉTODOS COLORIMÉTRICOS:
BIURET, LOWRY, BRADFORD, BCA.
Comparación de métodos
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Determinar la concentración de proteínas en una
muestra biológica es una técnica de rutina básica
cuando se aborda un esquema de purificación de
una proteína concreta, cuando se quiere conocer la
actividad
específica
de
una
preparación
enzimática, para el diagnóstico de enfermedades,
así como para otros muchos propósitos.
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

a)
b)
c)
Existen diferentes métodos para la
cuantificación de proteínas. Muchos de estos
métodos se basan en:
la propiedad intrínseca de las proteínas para
absorber luz en el UV,
para la formación de derivados químicos, o
la capacidad que tienen las proteínas de unir
ciertos colorantes.
LEY DE LAMBERT - BEER
Relaciona
la absorción de luz con
las propiedades del material
atravesado.
LEY DE LAMBERT Y BEER
La ley explica que hay una relación exponencial
entre la transmisión de luz a través de una
sustancia y la concentración de la sustancia, así
como también entre la transmisión y la longitud
del cuerpo que la luz atraviesa.
 Si conocemos l y A, la concentración de la
sustancia puede ser deducida a partir de la
cantidad de luz transmitida.

A = ε·c·l
Donde:
 A = absorbencia
  = Coeficiente de extinción molar.
 l = longitud de la celda.

COEFICIENTE DE EXTINCIÓN
MOLAR


Es una medida de la cantidad de luz absorbida
por unidad de concentración.
Un compuesto con un alto valor de coeficiente
de extinción molar es muy eficiente en la
absorción de luz de la longitud de onda
adecuada y, por lo tanto, puede detectarse por
medidas de absorción cuando se encuentra en
disolución a concentraciones muy BAJAS.
MÉTODOS PARA DETERMINAR PROTEÍNAS
Intervalo del UV
Todas la proteínas pueden ser detectadas, sin
embargo solo ciertos residuos de aminoácidos son
los que se leen en la región del UV.

Por reacciones colorimétricas:
Enlaces peptídicos o ciertos aminoácidos
reaccionan y los productos coloridos son los que
se cuantifican

PROTEÍNAS Y LA ABSORCIÓN EN LA
REGIÓN UV
Las bandas de absorción más significativas se
encuentra en el ultravioleta cercano, en el
intervalo de longitud de onda entre 230 y 300 nm.
 Concretamente absorben en este rango las
cadenas laterales de los aminoácidos
aromáticos, la histidina y la cistina.
 La cistina presenta una banda centrada a 250
nm, n-->s* (max ~ 300 M-1.cm-1), pero apenas
se puede considerar, ya que es muy débil y el
porcentaje relativo de puentes disulfuro es muy
pequeño en una proteína.

PROTEÍNAS


Los aromáticos absorben de 260-290 nm. La
fenilalanina. Es el menos importante cuantitativamente, aunque
muestra un espectro complejo con múltiples bandas
diferenciadas en torno a 250-260 nm. Presenta también bandas
de mayor energía que solapan con el espectro del enlace peptídico
en 215 y 180 nm. Sin embargo como no absorbe por encima de
280 nm su contribución al espectro en la zona del ultravioleta
cercano de proteínas suele ser pequeña.
La tirosina presenta un máximo a 275 nm con un
hombro a 285 nm. La banda se desplaza a mayores
longitudes de onda cuando se produce la desprotonación del OH
del anillo aromático.

El triptófano agrupa al menos tres bandas diferentes.bajo el
espectro centrado a 280 nm. También presenta bandas en la
zona del UV lejano.
CALCULAR LA CONCENTRACIÓN DE
PROTEÍNAS: MÉTODO UV
Se usará la ecuación de Lambert y Beer.
 El coeficiente de extinción molar de la Albumina
de Suero Bovino (BSA) que es 43 824 M-1 cm-1 o
bien usando el coeficiente dado en porcentaje que
es de 6.6 para una solución de BSA al 1% (10
mg/mL)
 La fórmula para determinar la concentración de
la muestra.


DESARROLLO EXPERIMENTAL
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL
MÉTODO ABS 280 NM.
1.
2.
3.
4.
Descongelar sólo las alícuotas de las fracciones
de proteína destinadas para este protocolo y que
fueron recolectadas durante la purificación de la
lactato deshidrogenasa.
Mantener las fracciones en un recipiente con
hielo durante todo el experimento.
Colocar las fracciones en cuvetas de
metacrilato grado UV.
Leer la absorbancia las fracciones que te
indique tú profesor a la longitud de 280
nm.
CALCULAR LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS
CON LA FÓRMULA Y LLENAR LA TABLA
Tubo
Absorbancia
Concentración (µg/µL)
F0
F1
F2
F3
F4
FPA
FPB
NO SE NECESITA HACER CURVA PATRÓN
PERO PARA LOS MÉTODOS COLORIMÉTRICOS SE
NECESITA UNA: CURVA PATRÓN
Es un marco de referencia que se construye de
cantidades conocidas de una sustancia (por ejemplo
la albúmina sérica bovina) que se utiliza para
determinar la cantidad de proteínas presente en
una muestra incógnita.
 En determinaciones colorimétricas, se cumple una
relación proporcional entre la magnitud o
intensidad de color que da una reacción y la
cantidad del reactivo que la provoca.
 La
intensidad de color se mide con un
espectrofotómetro o colorímetro en función de las
concentraciones crecientes de la sustancia se
obtiene una recta. Es decir, a mayor cantidad de
proteína, mayor cantidad de producto de reacción y
por lo tanto, mayor intensidad de color.

BLANCO


La absorbancia de una solución es la resultante de la
absorbancia del soluto cuya concentración se desea conocer
y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos)
que absorben también a esa longitud de onda.
Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para
ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga
todas los componentes del sistema menos aquel que se
desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia
de éste debe restarse a las muestras problema y a los
patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a
absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmitancia.
CURVA PATRÓN
BIURET
Se basa en la formación de un complejo coloreado
entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces
peptídicos en medio básico.
1Cu2+ se acompleja con 4 NH.
 La intensidad de coloración es directamente
proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces
peptídicos) y la reacción es bastante específica, de
manera que pocas sustancias interfieren.
 La sensibilidad del método es muy baja y sólo se
recomienda para la cuantificación de proteínas en
preparados muy concentrados (por ejemplo en
suero).

REACCIÓN DE BIURET

La reacción debe su
nombre al biuret, una
molécula formada a
partir de dos de urea
(H2N-CO-NH-CO-NH2),
que es la más sencilla
que da positiva esta
reacción, común a todos
los compuestos que
tengan dos o más
enlaces peptídicos
consecutivos en sus
moléculas.
BIURET
La presencia de proteínas en una mezcla se
puede determinar mediante la reacción del
Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en
solución acuosa alcalina (gracias a la presencia
de NaOH o KOH).
 La reacción se basa en la formación de un
compuesto de color violeta, debido a la
formación de un complejo de coordinación entre
los iones Cu2+ y los pares de electrones no
compartidos del nitrógeno que forma parte de los
enlaces peptídicos.

LOWRY
ESTE PROCEDIMIENTO INVOLUCRA LA
FORMACIÓN DE UN COMPEJO COBRE PROTEÍNA EN SOLUCIÓN ALCALINA.
 ESTE COMPLEJO REDUCE AL REACTIVO
FOSFOMOLIBDICO- FOSFOTUNGSTATO LO
QUE PRODUCE UNA INTENSA COLORACIÓN
AZUL.

ESTE MÉTODO CONSTA DE DOS ETAPAS:



Primera reacción Biuret. Los iones Cu2+, en medio
alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con
los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos
complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además,
provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional
de la proteína, exponiéndose los residuos de tirosina que
van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+
se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo
con tartrato.
Segunda reacción reactivo de Folin- Ciocalteau. La
reducción, también en medio básico, del reactivo de FolinCiocalteau por los grupos fenólicos de los residuos de
tirosina presentes en la mayoría de las proteínas, actuando
el cobre como catalizador.
El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau
es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al
ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo
de color azul intenso.
BIBLIOGRAFÍA

O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr y R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)
Este método se basa en la reacción de Biuret, donde los enlaces
peptídicos reaccionan con el Cu2+ en condiciones alcalinas produciendo
Cu+, después se reduce el reactivo de Folin por las proteínas tratadas
con cobre a azul heteropolimolibdeno. El color se desarrolla en la
segunda reacción (con el fosfomolibdotungstato) y es primeramente
debida a los aminoácidos tirosina, triptófano, y en menor grado por
cisteína, cistina e histidina.
BRADFORD
 Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue




G-250 (también Serva Blue) a las proteínas.
El colorante, en solución ácida, existe en dos formas
una azul y otra naranja.
Las proteínas se unen a la forma azul para formar un
complejo proteína-colorante con un coeficiente de
extinción mayor que el colorante libre.
Este método es sensible (1-15 μg), simple, rápido,
barato y pocas sustancias interfieren en su
determinación.
Entre las sustancias que interfieren están los
detergentes y las soluciones básicas.
BRADFORD
El ensayo de Bradford es un ensayo colorimético
para la medición de proteína total en una
solución dada.
 Involucra la unión de un colorante el Coomassie
® Brilliant Blue a las proteínas en un medio ácido
y su conmitante cambio de absorbancia de 465 a
595 nm.
 Debido a que el reactivo causa la precipitación de
la proteína con el tiempo, la linearidad de la
reacción se encuentra comprometida. Las
mediciones hay que concluirlas rápidamente.

DIFERENTES

El azul de Coomassie se une aproximadamente
estequiométrica, entonces el método de detección
tanto en solución como en PAGE-SDS, gel u otras
matrices es el método preferido, cuando las
concentraciones de proteínas se deben
determinar por densitometría.
CAMBIO DE ABSORBANCIA
BLUE


Los aminoácidos que
son reconocidos por el
colorante son arginina,
fenilalanina, triptofano
y prolina.
El azul de Coomasie
libre se detecta a 470
nm mientras que la
forma unida a
proteínas a 595 nm. Lo
anterior debido a que
el Coomassie se une
preferencialmente a
los aa mencionados y
cambio de un estado
catiónico a uno iónico
DEL COOMASIE
EL AZUL DE COOMASIE Y LOS
AMINOÁCIDOS QUE RECONOCE
BCA
El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de
formar un complejo púrpura intenso con iones Cu1+ en medio
alcalino.
Este reactivo forma la base de un método analítico capaz de
monitorizar el ión cuproso producido en una reacción entre las
proteínas con Cu2+ en medio alcalino (reacción de Biuret).
 La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un
método para la cuantificación de proteínas que es sencillo,
rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a
compuestos que afectan a otros métodos.
OHProteína + Cu2+
Cu1+
Cu1+ + BCA
complejo púrpura BCA- Cu1+
CUADRO COMPARATIVO DE SENSIBILIDAD DE
LAS TÉCNICAS DE CUANTIFICACIÓN DE
PROTEÍNAS
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Determinación de proteínas