Aboud, Mariana
Merwaiss, Fernando
Renner, María
Stem cells
• Responsables de mantenimiento y reparación de tejidos
• Se dividen para suplir faltas
Autorrenovación de stem
cells durante la división
Alta frecuencia de replicación
Mutaciones
Checkpoints
Pero baja capacidad de reparación de DNA
Cáncer
Necesidad de un mecanismo para limitar acumulación
de mutaciones inducidas por replicación.
Hipótesis de la cadena inmortal
John Cairns (1975)
• Cromosoma recién sintetizado
1 hebra templada (abuela)
1 hebra nueva (madre)
Errores por replicación
Hipótesis: Mecanismo distingue cromátidas por edad.
Separa cadenas abuelas (a una célula hija) de las cadenas
madre (a la otra célula).
División celular asimétrica
Cosegregación de cromátidas por edad
Hebra inmortal retenida en stem cell
• Célula con templado
abuelo (azul)
stem cell (autorrenovación)
• Célula con templado más
nuevo (rojo o gris)
a diferenciación
Segregación random y no random
Extremo: stem cells retienen cadenas originales toda la vida.
Código genético original preservado
Ventajas de la hipótesis
• La célula hija, con destino diferenciado, contendrá las
mutaciones de la replicación.
• El pool de stem cells retendrá el templado original durante la
vida del organismo.
• Las stem cells con cadenas inmortales no están sujetas al
acortamiento telomérico durante la replicación.
Asumen que el intercambio entre cromátidas hermanas y
la recombinación mitótica son extremadamente bajas.
Suponen que las cadenas de DNA son diferenciables en
su rol como templado en la replicación.
Evidencias
Apoyo de la Teoría Inmortal
Evidencias
• Fibroblastos de embriones con 3H-Timidina (Lark et al., 1966)
Cuantificación de la distribución de marcación en sucesivas
generaciones
Segregación no random de cadenas marcadas
• Repetición en plantas y hongos (Lark et al., 1967)
Cosegregación de las marcadas
• En mamíferos: trabajaron con stem cells del epitelio intestinal.
Intentaron marcarlas durante su formación (Potten et al.,1978,
2002)
Largos períodos de retención
Experimentos convincentes
(Potten et al., 2002)
Cadenas marcadas con 3H-Td
Se agrega BrdU para marcar las recientemente sintetizadas
• Se ven ambas marcaciones en la mayoría de las
células
proliferación
• Días después las células con 3H-Td pierden BrdU
Stem Cells del músculo esquelético
• Uso de marcadores diferenciales en las múltiples
divisiones permite ver: (Conboy et al., 2007)
 Las células hijas obtienen diferentes destinos.
 Las cadenas más viejas quedan en la célula de fenotipo
menos diferenciado.
 Progenitores marcados in vivo presentaron una
frecuencia de división asimétrica del 50%
aproximadamente
Para estudios futuros
• La falta de un marcador in situ no permite obtener
resultados inequívocos.
• Experimentos realizados in vitro deberían poder
repetirse in vivo.
• Descubrimiento de los mecanismos moleculares.
En este ensayo se resumen varias objeciones a la hipótesis
de la hebra inmortal y se discuten algunas limitaciones
sobre los enfoques experimentales que ponen a prueba la
misma.
 Solo ha sido probada en tejidos de mamíferos, en los cuales la
identidad de las stem cells todavía es incierta.
 No es claro qué fracción de las divisiones celulares llevan a cabo
dicha división asimétrica.
Pueden generarse mutaciones si se producen fallas en la reparación
del ADN.
Los genes en la nueva hebra sintetizada deberían mostrar muchas más
mutaciones que los que se encuentran en el templado.
 Los mecanismos de reparación SCE interferirían con el mantenimiento
de la hebra inmortal.
 La disminución de los telómeros ocurre en las stem cells que
retengan o no a las hebras templado.
 La secuencia de bases no es el único determinante entre el normal
desarrollo o la formación de un tumor.
 No hay reportes que indiquen que las células de la línea germinal o
las células embrionarias muestren segregación asimétrica.
Todas las experiencias existentes describen
aproximaciones indirectas que sufren de varias limitaciones:
• Algunas células que retienen la marca pueden haber sido células
que se diferenciaron después de la mitosis en lugar de stem cells
divididas asimétricamente.
• Evidencia de la segregación asimétrica del ADN marcado en cultivos
puede haber venido de células que no están relacionadas y que se
juntaron cuando se las fijó en el cultivo.
• La mayoría de la información publicada son ilustraciones mostrando
imágenes cualitativas mas que información cuantitativa.
¿Podría haber otra explicación?
La hipótesis de la “hermana silenciosa”
Una explicación alternativa a la hipótesis de la hebra inmortal es que la
división celular asimétrica y el destino de las células son codirigidas por
diferencias epigenéticas entre cromátidas hermanas (tanto en los
centrómeros como en ciertos sitios del genoma).
Hace referencia a todos aquellos factores no genéticos que
intervienen en la determinación del desarrollo de un organismo
Las dos cromátidas hermanas en cromosomas metafásicos llevan
distintas marcas epigenéticas (indicadas con + y -) en los centrómeros y
en ciertos genes que determinan a las stem cells (A, expresado; a,
silenciado).
Las diferencias epigenéticas entre los centrómeros permiten la
segregación específica durante la mitosis. Esta segregación asimétrica
de las cromátidas regula la expresión de ciertos genes presentes en las
mismas en las células hijas.
Segregación asimétrica
Una célula hija se
diferencia (D)
(Tiene las copias
silenciadas de los genes
de autorrenovación)
La otra continua
siendo una stem
cell (S)
(Tiene las copias
activas de los
genes de
autorrenovación)
Segregación al azar
Las dos células hijas continúan siendo stem cells
Ambas células hijas heredan una mezcla al azar de genes activos e inactivos,
lo cual generalmente restaura la expresión de los genes de las stem cells en
ambas si las células reciben las señales apropiadas desde el microambiente
(el nicho de stem cells).
Objetivo
Encontrar evidencia directa de la segregación de viejos y
nuevos templados en la regeneración de progenitores
miogénicos.
Metodología: Herida en músculos
Músculos de las extremidades
Inyecciones de Cardiotoxina I
en 24 sitios
Herida necrótica difusa
Activación de stem cells
Regeneración
Marcado con CldU e IdU
Herida en músculo
48 hs
Pulso de CldU
12 hs
Pulso de IdU
Modelos de segregación al azar y no al azar
de cadenas templadas.
Marcadas con CldU en un ciclo y con IdU en el siguiente.
Naturaleza de células y estado del ciclo celular
Marcado con CldU e IdU
Disección del músculo
Disociación de fibras por trituración o digestión
Plaqueo de a 1 célula
Fin de mitosis
Bloqueadas en citocinesis
Fijado y lavado
Permeabilizado
Incubado con
Chicken IgY anti-Syn-4
Ab secundario
Incubado con
Mouse anti-Pax7
Incubado con
Rat anti-Ki67
Ab secundario
Ab secundario
Naturaleza de células y estado del ciclo celular
• Modo de detección Microscopía inmunofluorescente
Células miogénicas
Células en proceso de replicación
Cuantificación de pares positivos para
los marcadores (80%)
Syn-4, Pax7: marcadores de células miogénicas.
Ki67: marcador de proliferación celular.
Análisis de distribución de marcas de CldU e IdU
Marcado con CldU e IdU
Disección del músculo
Disociación de fibras por
trituración
Plaqueo a baja densidad
Fin de mitosis
Bloqueadas en citocinesis
Ambas marcadas con IdU
Hubo replicación en el 2º ciclo
Fijado
Sólo una marcada con CldU
Permeabilizado
Incubado con Ab anti-CldU
y anti-IdU
En el 2º ciclo, todas las cromátidas hijas sintetizadas
en el 1º ciclo (cadenas madre) van a una sola
célula hija.
Cuantificación de pares asimétricos
• En la experiencia anterior (in vivo) hay segregación asimétrica
en el 50% de los casos.
• En sistema ex vivo hay segregación asimétrica en el 30% de los
casos.
• En un sistema in vitro (mioblastos proliferando) hay segregación
asimétrica sólo en el 5% de los casos.
50%
Es importante el contexto para la
segregación asimétrica (stem cell niche).
30%
5%
Protocolo alternativo: marcado con BrdU
Herida en músculo
48 hs
Pulso de BrdU
Par simétrico
Disección del músculo
Disociación de fibras por trituración
Par asimétrico
Plaqueo a baja densidad
Fin de mitosis
Bloqueadas en citocinesis
Fijado
Permeabilizado
Incubado con Abs
Se observa el mismo porcentaje de segregación
asimétrica que en el protocolo anterior (en la
mitad de las células).
Experimento enfocado en la proliferación de las
stem cells miogénicas y de su progenie
• Examinaron pares de células con expresión diferencial de
Desmina.
Desmina: Su expresión es considerada marcador de
diferenciación.
• Analizaron pares marcados asimétricamente con BrdU y
expresión de Desmina.
Método de marcado: Co-Inmunotinción
Herida en músculo
Pulso de BrdU
Disección del músculo
Plaqueo de a 1 célula
Fin de mitosis
Bloqueadas en citocinesis
Fijado
Permeabilización
Incubado con Ab primario
Rat anti-BrdU
Rabbit anti-Desmin
Incubado con Ab secundario
Detección por
microscopía de
inmunofluorescencia
Destino celular asociado a la segregación
79%
Relación entre templado
“joven’’ (BrdU+) y
destino diferenciado
(Des+)
Cuantificación de expresión de Desmina en progenie con
segregación simétrica de BrdU (50% del total)
59%
31%
9%
División simétrica División simétrica
a progenitores
a mioblastos
Sca-1
• Marcador de progenitores indiferenciados
• Derivado de músculo esquelético
Desmina
Debido a la estrecha relación existente entre la asimetría de
Desmina y la de BrdU, la Desmina será utilizada como
marcador de la segregación asimétrica de los templados
marcados.
Relación entre segregación asimétrica y destino celular
diferenciado
84%
Cadena más “vieja” (Des-)
con más destino
indiferenciado (Sca-1+)
Cuantificación de la expresión de Sca-1 en progenie con
expresión de Desmina simétrica
~100%
Consistente con resultados anteriores.
FACS (fluorescence-activated cell sorting)
Esta técnica permite que se puedan medir varias características determinadas de una
única célula mientras fluye en un líquido. Este instrumento puede recopilar
información acerca de las células midiendo las emisiones de luz visible y fluorescente,
lo que permite la clasificación de las células basada en características físicas,
bioquímicas y antigénicas.
Correlación de la segregación de las hebras templado
con el destino celular en progenitores miogenicos.
(A) Se muestra un ploteo
representativo de Sca-1 versus
CldU en la población antes y
después de la división celular.
(B) Cuantificación de los ploteos
mostrados en (A)
Conclusiones
Modelo propuesto:
División asimétrica
Stem cells
musculares
División simétrica
Se puede extender la asociación de la co-segregación de las hebras
templado a una gama más amplia de decisiones de las células madre mas
allá de la autorrenovación.
Este sistema promete ser valioso para el estudio de los mecanismos de
la herencia asimétrica de las hebras templado de ADN.
Se puede confundir la interpretación de estudios anteriores que hasta
ahora han supuesto una relación geométrica simple entre la dilución del
ADN marcado y la historia replicativa.
Los resultados sugieren un proceso alternativo por el cual una célula,
incluso aquellas que se dividen muy rápidamente, podría incorporar el
ADN marcado y generar una progenie que retenga la marcación.
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Evidencias