PCR
Fundamentos, variantes y aplicaciones
MSc. Rocío Inga Peña
Dpto. Bioquímica, Biologia Molecular y Farmacología
Universidad Peruana Cayetano Heredia
REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
1985 - Mullis & Falloona
Amplificación enzimática de un fragmento de DNA
(simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)
Síntesis de ácidos nucleicos: generalidades
• La hebra nueva de DNA o RNA se sintetiza en
dirección 5’ 3’
• Las RNA polimerasas pueden iniciar la síntesis de
una cadena nueva utilizando una hebra molde
• Las DNA polimerasas además de la hebra molde,
necesitan un iniciador (primer o cebador de
extensión)
• La Transcriptasa Reversa es una DNA polimerasa
RNA-dependiente.
Basta un primer
Cadena líder
(Leading Strand)
Primer (riboNTPs)
Fragmento de Okasaki
Cadena rezagada
(Lagging Strand)
LA SINTESIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS ES SIEMPRE DE 5´ 3´.
Eventos en la Replicación del DNA:
• Apertura de las cadenas (orígen de replicación)
• Colocación de los iniciadores (primers de RNA)
( La cadena líder utilizará un solo iniciador mientras que las
cadenas rezagadas utilizarán varios iniciadores de RNA.)
• Síntesis de cadenas de DNA (partiendo de los iniciadores)
• Eliminación de los iniciadores de RNA.
• Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA
ligasa)
ELEMENTOS QUE SE REQUIEREN EN
LA SINTESIS DEL DNA POR PCR
 Hebra Templado
 Iniciador (cebador, primer): secuencia corta de
nucleótidos complementaria a la hebra templado.
La enzima DNA polimerasa sólo puede iniciar la síntesis
de una cadena de DNA a partir de un 3’OH libre.
 dNTPs : desoxirribonucleótidos tri-fosfatados
 DNA Polimerasa
Temperatura
100
Melting
94 oC
PCR
50
0
Tiempo
DNA de
cadena doble
3’
5’
5’
3’
Temperatura
100
Melting
94 oC
PCR
50
0
Tiempo
3’
DNA de
cadena simple
5’
Calor
5’
3’
Temperatura
100
Melting
94 oC
50
PCR
Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC
0
Tiempo
3’
5’
5’
Hibridación
de primers
5’
5’
3’
Temperatura
PCR
100
Melting
94 oC
50
Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC
0
Tiempo
3’
5’
Calor
5’
5’
Calor
5’
5’
3’
30 ciclos
Temperatura
PCR
100
Melting
94 oC
50
Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC
0
Tiempo
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
3’
30ciclos
Temperatura
PCR
100
50
Melting
94 oC
Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC
0
3’
5’
5’
Tiempo
5’
5’
5’
3’
Calor
5’
5’
Calor
5’
30ciclos
Temperatura
100
50
Melting
94 oC
PCR
Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC
0
3’
5’
5’
5’
5’
5’
Tiempo
5’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
30ciclos
Temperatura
PCR
100
Melting
94 oC
50
Melting
94 oC
Extension
Annealing
72 oC
Primers
50 oC
0
3’
5’
5’
5’
5’
5’
Tiempo
5’
3’
Fragmentos de
tamaño definido
5’
5’
5’
5’
5’
5’
30ciclos
El numero de copias del DNA delimitado por los primers
se duplica en cada ciclo de PCR.
Numero de copias
1
2
4
0
1
# ciclos
2
8
16
32
64
3
4
5
6
VENTAJAS DE PCR SOBRE
OTRAS TECNICAS
 ALTA SENSIBILIDAD
 ALTA ESPECIFICIDAD
 RAPIDEZ
DESVENTAJA:
PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA
templado específico o productos amplificados previamente)
TECNICAS DERIVADAS/ BASADAS EN PCR
 RT-PCR
: detección de mRNA
 PCR Nested: amplificación de una secuencia dentro de otra
previamente amplificada
 PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultánea
 In situ PCR : detección en tejido mismo, ubicación del fragmento
 IC-PCR
 PCR-RFLP :
 Real
: inmunocaptura previa a PCR
polimorfismo genético (usado más que RAPDs)
Time PCR : cuantificación de copias iniciales – en tiempo real
PCR Multiplex
- Varias secuencias target en forma simultánea.
- La eficiencia de amplificación de ambos targets no es
necesariamente la misma:
- Secuencia de DNA de los diferentes targets
(%GC)
- Temperatura de hibridación de los diferentes
primers
- Tamaño de las diferentes secuencias target
- Artefactos / dímeros entre diferentes primers.
Consiste en dos pasos:
• Transcripción reversa
RT-PCR
• PCR
mRNA
OBJETIVO:
Detección de la expresión de
un gen – por presencia de
mRNA
cDNA (simple cadena)
cDNA (doble cadena)
PCR
Transcripción Reversa
1. Purificación de RNA mensajero
2. Transcripción reversa a cDNA (DNA copia)
RAPD of P. aeruginosa
Immuno-PCR
- DETECCION DE ANTÍGENO ESPECÍFICO POR EL
ANTICUERPO ESPECIFICO
- ALTA SENSIBILIDAD - POR PCR
Immuno-PCR vs ELISA
S
B
St
antibody with B
linked DNA
antibody with
linked enzyme
protein
Immuno-PCR
P
E
protein
ELISA
El Producto de PCR puede ser detectado por
electroforesis o por ELISA
APLICACIONES DE PCR EN MEDICINA
• Detección de cantidades mínimas (diagnóstico temprano en
pacientes asintomáticos)
• Monitoreo de terapia (por ej. disminución de carga viral)
• Evaluación de terapia - pronostico de recaída
• Detección de cepas resistentes a antibióticos
• Detección temprana de Citomegalovirus y otros patógenos en
pacientes con transplante de órganos (por inmunosupresión
y mayor riesgo a infecciones latentes)
MUESTRAS QUE PUEDEN
SER EVALUADAS POR PCR
PATOGENOS QUE PUEDEN SER
DETECTADOS POR PCR
•Sangre
- Bacterias
•Mucosa
- Hongos
•Tejido
- Parásitos
•Orina
- Virus
•Heces
- Mutaciones en Genes
•Líquido cefalorraquídeo
- Ausencia /Deleción de
genes
USOS DE LA TECNOLOGIA MOLECULAR
EN LA SOCIEDAD
• Medicina : Diagóstico Molecular:
Enfermedades geneticas
Enfermedades infecciosas
• Identificación genética y filiación (Pruebas de paternidad,
medicina forense, pedigree de animales, etc...)
• Mejoramiento genético en animales y plantas
• Productos biomédicos
• Terapia génica
REAL TIME PCR
INTRODUCCION
- PCR (estandar)
- RT-PCR
- PCR Cuantitativo (end point analysis)
- PCR en tiempo real (análisis de la cinética de
reacción)
- ventajas
- desventajas
- aplicaciones
Cuantificación de copias de mRNA
1. Diferencias en la expresión de genes (por efecto de drogas
por ejemplo)
2. La poca cantidad de mRNA disponible en ciertos
procedimientos:
•células obtenidas por LCM (laser capture microdissection)
•cantidades pequeñas de tejidos
•células primarias
REAL TIME PCR - PCR EN TIEMPO REAL
•Cuantificación del número de copias de DNA
presentes en la muestra (diagnóstico, monitoreo de
carga viral, comparación entre número de copias en
diferentes subespecies, etc.)
•Cuantificación del mRNA por RT-PCR en tiempo real
(análisis de la expresión de genes en diferentes
tejidos o en diferentes condiciones normales vs
patológicas, efecto de drogas, etc)
•Análisis de la cinética de la reacción
PCR en tiempo real
• Detección y cuantificación de reporteros fluorescentes.
• La fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de
producto formado en cada ciclo de PCR.
• Reporteros fluorescentes: TaqMan, Beacons
moleculares, SYBR Green
TaqMan PCR
Sonda específica
SYBR Green
• Agente que se intercala
en DNA de doble
cadena.
• Desventaja: se une a
CUALQUIER DNA de
doble cadena (dímeros
de primers y productos
inespecíficos).
DNA copy number
Copies of DNA=2N
1.8E + 09
1.6E + 09
1.4E + 09
1.2E + 09
1.0E + 09
8.0E + 08
6.0E + 08
4.0E + 08
2.0E + 08
0.0E + 00
0
5
10
15
20
25
30
35
P C R cycle
10
9
8
D N A co p y n u m b er (lo g )
1
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1,024
2,048
4,096
8,192
16,384
32,768
65,536
131,072
262,144
524,288
1,048,576
2,097,152
4,194,304
8,388,608
16,777,216
33,554,432
67,108,864
134,217,728
268,435,456
536,870,912
1,073,741,824
1,400,000,000
1,500,000,000
1,550,000,000
1,580,000,000
D N A co p y n u m b er
CYCLE NUMBER
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
7
6
5
4
3
2
1
0
0
5
10
15
20
25
30
35
P C R cycle
PCR reagent is the limiting factor!!
CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NUMERO DE CICLOS
Se observa diferencias en los ciclos iniciales. Relación como línea recta
al utilizar logaritmos, porque la amplificación por PCR es una reacción
logarítmica.
Real Time PCR
3. intensifier
1. halogen
tungsten lamp
2b. emission
filters
2a. excitation
filters
4. sample plate
5. ccd
detector
350,000
pixels
Amplification Plot of real-time PCR
DNA copy number (log)
Log phase
Level off/ plateau
2
4
8
16
32
PCR cycle (Ct)
PROBLEMAS
PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : que
pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida
durante la reacción. Esto es mas frecuente cuando se utiliza
SYBR-green.
ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS:
• Unión inespecífica de primers (mispriming): por unión de los
primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en
el DNA o cDNAs de la muestra
• Dímeros : los primers pueden hibridarse entre ellos creando
productos pequeños
CURVA DE DENATURACION
Muesta el perfil de denaturación de los productos
amplificados.
Si un producto presenta un perfil de denaturación diferente
(valores de Tm diferentes), significa que es otro producto (no
específico) de amplificación, pueden ser dímeros.
CURVA DE DENATURACION DE DILUCIONES
(se observan dímeros, de menor temperatura de fusión)
dímeros
DISEÑO EN PLACA
Ventajas del PCR en tiempo real
•
•
•
•
•
•
Simple y rápida (semi-automatizada).
No hay manipulación post-PCR.
Eliminación de contaminación por amplicones.
Cuantificación del DNA o RNA molde inicial.
Muy sensible.
Detección de productos inespecíficos con la opción
“curva de desnaturalización” (Melt-Curve).
• Detección de más de un producto específico en una
misma reacción.
• Extraordinariamente específico.
Journal of Virological Methods 102:119-128, 2002
Journal of Clinical Virology 28:233-238, 2003
DIAGNOSTICO MOLECULAR
EN EL FUTURO
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