Utilización de la prueba de
amplificación de ácidos nucleicos
(NAAT) para el diagnóstico de
Clamidia y Gonorrea.
Victor N. Torres Álvarez, BS
Tania N. Pérez Del Río, BS
Vilmarie Figueroa Nieves, BS
Katian Meléndez González, BS
1
Objetivos
• Dar una breve explicación sobre clamidia y gonorrea, su
patología y los métodos tradicionales de diagnóstico.
• Presentar técnicas alternas para el diagnóstico eficiente de
clamidia y gonorrea.
• NAAT
• Mostrar técnicas automatizadas para el diagnóstico de
clamidia y gonorrea, tomando como base la técnica de
amplificación de ácidos nucleídos
2
Introducción
Chlamydia trachomatis & Neisseria gonorrhoeae:
1.
Bacterias comúnmente conocida por causar enfermedades de
transmisión sexual (ETS) que afectan a mujeres y hombre.
Chlamydia trachomatis
Neisseria gonorrhoeae
3
Introducción:
Chlamydia trachomatis
(sintomas)
Si no se trata, el 20% de
los que tienen PID
sintomático podría llegar a
ser estériles.
30% ♀ con infecciones no
tratadas C. trachomatis
desarrollados enfermedad
inflamatoria pélvica (PID)
18% experimentará dolor
pélvico debilitante y
crónica.
9% tendrá un embarazo
ectópico en peligro la vida
4
Introducción:
Chlamydia trachomatis
♀ Infecciones durante el embarazo puede ocasionar al infante conjuntivitis,
neumonía y endometritis posparto materna.
Neumonía
Conjuntivitis
5
Introducción:
Chlamydia trachomatis
♀ Infecciones durante el embarazo puede ocasionar al infante conjuntivitis,
neumonía y endometritis posparto materna.
En ♂ la uretritis es la enfermedad más común que resulta de la infección. Las
complicaciones (por ejemplo, epididimitis) afectan a una minoría de hombres
infectados y rara vez resultan en secuelas de salud reproductiva.
Uretritis
Epididimitis
6
Introducción
Chlamydia trachomatis
Infección rectal son típicamente asintomáticos pero pueden progresar a
proctocolitis.
7
Introducción
Chlamydia trachomatis
Artritis reactiva adquirida sexualmente también se ha reportado como una posible
consecuencia de la infección.
8
Introducción:
Neisseria gonorrhoeae
Tienden a causar una respuesta
inflamatoria fuerte que C.
trachomatis.
♀ típicamente asintomática con
complicaciones tales como PID
(inflamatoria pélvica )
♂ infección uretrales causan uretritis
con dolor al orinar, la epididimitis o
infección gonocócica diseminada
9
Introducción:
Recomendaciones del CDC.
Individuos
Personas sexualmente activas
la evaluación rutinaria de
laboratorios
Laboratorios
La Utilización de diversos
procedimientos de
detección más
específicos para mejorar
la identificación de las
bacterias
Comunidad
Promover la
Comunicación y
Educación para la
prevención y
tratamientos disponibles.
10
Técnicas de Detecci‫ٴ‬ón Basadas
en Cultivo
11
Diagnósticos Básicos de Bacteriología
• Aislamiento e identificación de Chlamydia trachomatis
• Swabs especial
• Uretra masculina
• Conducto cervical
• Almacenaje
• ≤4 ° C dentro de 24 horas
• -70 ° C > 24 horas
http://www.mysynergylab.com/resources/microbiology_
collection_appendix/genprobe.aspx
• Inócula
• Centrifugación en una monocapa
• McCoy
• HeLa 229
• Buffalo Green Monkey Kidney Cells
12
Diagnósticos Básicos de Bacteriología
• Cultivo para C. trachomatis
• Método varía entre Laboratorios
• Prueba diagnóstica más sensible para la infección por clamidia
hasta la introducción de NAAT.
• Sensibilidad baja prolonga el tiempo de entrega.
• Desventajas:
• Labor
• Complejidad
• Transporte
• Costoso
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Diagnósticos Básicos de Bacteriología
• Aislamiento e identificación de N. gonorrhoeae
• Swab especial
• Eje de plástico o alambre (otro tipo podría inhibir)
• Insertar uretra masculina
• Canal endocervical
• Uretritis
• Exudado
• Transporte
• Hasta 48 horas a RT
14
http://www.mysynergylab.com/resources/microbiology_collection_app
endix/genprobe.aspx
Diagnósticos Básicos de Bacteriología
Inóculado con el swab directamente al medio
Requisitos nutricionales y ambientales
Incuba en atmósfera enriquecida con CO2 a la
mayor brevedad
15
Diagnósticos Básicos de Bacteriología
• Medios utilizados:
• Muestras en áreas no estériles
• Medios selectivos
• Thayer-Martin o Martin-Lewis
http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0001
-63652005000300003
• Muestras áreas estériles
• Medios no selectivos
• Agar chocolate
• Medios para aislar N. gonorrhoeae
• Agar chocolate + agar sangre
16
Diagnósticos Básicos de Bacteriología
• Aislamiento e identificación de N. gonorrhoeae
• Características presuntivas:
Aislados de
muestra genitales
en medios
selectivos
Diplococos gram–
oxidasa +
N. gonorrhoeae.
17
Diagnósticos Básicos de Bacteriología
18
Diagnósticos Básicos de Bacteriología
• Cultivo para N. gonorrhoeae
• Económico
• Especifico
• Sensitivo
http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/lecture15microbio.htm
• El manejo es fastidioso
• Recolección, transporte, tiempo
• Las cefalosporinas son la única clase de antibióticos
recomendados para el tratamiento de las infecciones de
N. gonorrhoeae.
19
Pruebas de sensibilidad a antibióticos
• Proporciona información limitada debido a cambios
genéticos en el cromosoma
• Resistencia a:
•
•
•
•
Penicilina
Tetraciclina
Espectinomicina
Fluoroquinolonas
• Mutaciones en el DNA gyrase (gyrA)
• Mutaciones en la topoisomerasa (ParC)
• Pruebas de las alteraciones genéticas
• Conocer completamente
• Asociación con la resistencia
20
Pruebas de sensibilidad a antibióticos
• Prueba de sensibilidad
• Cepas viable para documentar los marcadores genéticos exactos
• Se prueba en placas de dilución
• Valores de concentración inhibitorias mínimas
21
Pruebas de sensibilidad a antibióticos
• Métodos más simples para susceptibilidad
• Difusión en disco y E-test (Epsilometer test)
• No son aprobados por la FDA para su uso en los Estados Unidos.
• Pero parecen ser susceptibles
22
Pruebas de sensibilidad a antibióticos
• C. trachomatis
• Según el 2010 STD Treatment Guidelines
• Azitromicina frente a doxiciclina demostró que los tratamientos
son igualmente eficaces
• La eritromicina puede ser menos eficaz
• Efectos secundarios
• Levofloxacino y ofloxacino son alternativas de tratamiento
efectivas, mas costosas
23
NAAT (Nucleic Acid
Amplification Test)
24
NAAT
• Identifica secuencias de DNA o RNA especificas del
organismo de interés
• Sensitividad
• Habilidad de producir una señal positiva con solo una
sola copia de DNA o RNA
• No depende de organismos viables para la
recuperación de DNA
• NAATs comerciales han sido aprobados para detectar
ambos microorganismos a partir de:
• Muestras vaginales/endocervicales
• Muestras uretrales
• “First catch urine” (hombres y mujeres)
25
NAAT
26
Metodos
• Polymerase Chain Reaction (PCR)
• qRT-PCR
• Amplificacion del 16s RNA
• Strand Displacement Amplification (SDA)
27
Strand Displacement
Amplification (SDA)
• No basada en PCR
• Utiliza la polimerasa del fago phi 29 de Bacillus (Φ29 phage)
• Provee la capacidad de amplificar segmentos largos con una
frecuencia de error minima (1 en 9000)
• “Random Primers”
• No hay la necesidad de usar un ciclador termal
• Mayor producto que en un PCR
28
Strand Displacement
Amplification (SDA)
http://www.nature.com/nrmicro/journal/v6/n3/fig_tab/nrmicro18
62_F1.html
29
NAAT
• Ventajas:
• Por encima de 90% de sensitividad y mas de 98% de especificidad
• NAAT detecta de 20-50% mas infecciones causadas por clamidia que
por cultivo
• Utilización es especímenes no-invasivos
• Orina
• Pacientes con restricciones culturales o religiosas
• Diagnostico confiable en pacientes sintomáticos y
asintomáticos de gonorrea y clamidia
• Critico para el control de la enfermedad
30
NAAT
• Desventajas
•
•
•
•
Alto Costo
Requerimientos altos en control de calidad
Contaminación
Problemas relacionados a la secuencia
• Falsos positivos
• Secuencia podrían variar entre cepas
31
• Identificacion de cepas resistentes a antibióticos
• Mecanismos moleculares de resistencia
32
Sistemas automatizados
basados en NAAT
33
Abbott RealTime m2000 CT/NG
• Ensayo de amplificación in-vitro (PCR): C.
trachomatis y N. gonorrhoeae
• Muestras son obtenidas con hisopos de vagina,
endocervix y uretra (hombres) y/o orinas.
• C. trachomatis• Regiones conservadas para tipos salvajes y nuevas
variantes.
• Plásmidos (X06707) encontrados en todos las variantes.
• N. gonorrhoeae• Regiones del gen Opa
34
Roche cobas® 4800 CT/NG
• Detección in-vitro mediante amplificación (PCR) e
hibridización de ácidos nucleícos.
• Se basa en los siguientes pasos:
•
•
•
•
Preparación de la muestra
Amplicación de las secuencias utilizando primers con biotina
Hibridización de los amplicones con sondas específicas
Detección de los productos hibridizados por colorimetría
• C. trachomatis- secuencias del plásmido (CP102, 103) y
ADN cromosomal (CTMP 101,102) en muestras de
orinas, endocervicales o uretras.
• N. gonorrhoeae- ADN bacterial (DR-9) en
orinas y uretras (hombres), y endocervix.
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Cepheid Xpert® CT/NG Assay
• Detección mediante realtime PCR (cuantitativo).
• C.trachomatis – región distintiva del ADN cromosomal.
• N. gonorrhoeae- dos secuencias independientes de
ADN.
• Se obtiene resultados en 90 minutos.
• Pasos principales:
36
Hologic Aptima Combo 2 Assay
• Detección de CT/NG por amplificación mediada de
transcripción (TMA) de rRNA.
• Muestras en hisopos, orinas o pruebas de Pap (ThinPrep).
• Se basa en:
• Liberación y aislamiento de rRNA en el medio.
• Amplifica regiones de 23S rRNA en CT y 16S rRNA en GC.
• Detección de amplicones mediante hibridización de ácidos
nucleicos (sondas quimioluminiscentes).
37
BD ProbeTec ET CT/NG
• Utiliza la tecnología de SDA (Strand Displacement
Amplification)
• C. trachomatis- secuencias del plásmido (7,500 pb)
• N. gonorrhoeae- región de gen de proteína homóloga
de pili.
• Detección mediante transferencia de energía
fluorescente (ET).
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Conclusión
• Avances tecnológicos en el campo de diagnostico clínico han
permitido el diseño de técnicas moleculares para la detección
de patógenos.
• Esto nos permite no depender tanto en técnicas de cultivo.
• Además, ha permitido la disminución del tiempo requerido
para la identificación de un patógeno.
• Ya no hay limitaciones debido a la cinética de crecimiento del
organismo.
• Disminuye el periodo de evaluación.
• Por ende, pacientes pueden ser tratado con mayor efectividad y
rapidez, disminuyendo la progresión de la enfermedad y de
transmisión.
39
Referencias
• Gaydos et al., 2004. Comparison of Three Nucleic Acid Amplification
Tests for Detection of Chlamydia trachomatis in Urine Specimens. J
Clin Microbiol. Jul 2004; 42(7): 3041–3045.
• Jaton et al/. 2006. A Novel real-time PCR to detect Chlamydia
trachomatis in first-void urine or genital swabs. Journal of Medical
Microbiology (2006), 55, 1667–1674
• Lasken, R (2012). Genomic Sequencing of Uncultured Microorganims
from Single Cells. Nature Reviews Microbiology 10, 631-640
(September 2012)
• Schachter et al., 2005. Confirming Positive Results of Nucleic Acid
Amplification Tests (NAATs) for Chlamydia trachomatis: All NAATs are
not Created Equal. Journal of Clinical Micriobiology, Mar. 2005, p.
1372–1373
• Walker et al., 2008. Single Cell Genomics. Nature Reviews
Microbiology 6, 176-177
• Whiley et al., 2006. Nucleic Acid Amplification Testing for Neisseria
gonorrhoeae. J Mol Diagn. Feb 2006; 8(1): 3–15.
40
Referencias
• Guidelines for Managing Sexually Transmitted Infections.
Recuperado de:
http://silverbook.health.wa.gov.au/Default.asp?PublicationID=1&Se
ctionID=54
• Recommendations for the Laboratory-Based Detection of Chlamydia
trachomatis and Neisseria gonorrhoeae — 2014. Recuperado de:
http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/rr6302a1.htm
• https://www.abbottmolecular.com/us/products/infectiousdiseases/realtime-pcr/c-trachomatis-n-gonorrhoeae-ct-ngassay.html
• http://molecular.roche.com/assays/Pages/cobas4800CTNGTest.aspx
• http://www.hologic.com/sites/default/files/package%20inserts/502
487-IFU-PI.pdf
• https://www.bd.com/ds/technicalCenter/whitepapers/LR598.pdf
41
GRACIAS POR SU ATENCIÓN.
¿PREGUNTAS?
42
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Diagnostico de Clamidia y Gonorrea utilizando Muestra de