Nuevos patógenos y protocolos a
incorporar a PulseNet:
Shigella flexneri y
Enterobacter sakazakii
23 al 25 de octubre 2007
Norma Binsztein
Angela Salve
Desarrollo de
protocolo estandarizado de PFGE
para incorporación de
Shigella flexneri a PulseNet
Necesidades de un protocolo diferente
a) Shigella flexneri especie mas frecuente en América Latina y en Asia
b) PFGE de Shigella sonnei estandarizado en PulseNet
c)
Resultados de PFGE de aislamientos de Shigella flexneri
con el protocolo de Shigella sonnei
d) Pedido de PN-AL a PN-Internacional de estandarizar protocolo
de PFGE para Shigella flexneri
aceptación
Objetivo
Objetivos específicos
•
Utilizar las mismas condiciones de corrida para dos enzimas
•
Simple, económico, reproducible y epidemiológicamente
discriminatorio
Antecedentes
Serotipos
de Shigella
CDC
1,2,3
Instituto 1 a 6
Malbrán
Condiciones de
corrida
Shigella sonnei vs
Campylobacter vs
Yersinia pestis vs
Yersinia modificado
Shigella sonnei vs
Campylobacter
Enzimas
XbaI
NotI
XbaI
NotI
SfeI
Conclusiones
Yersinia
Modificado
XbaI / NotI
Campylobacter
XbaI / NotI
Grupo de trabajo en PFGE y
BioNumerics de Shigella flexneri
• Reunión Comité Directivo de PN Internacional
Providence, USA - 16 de Abril 2007
• Presentación de resultados preliminares
(CDC e Instituto Malbrán)
• Integrantes
CDC
NAMRU (US Naval Medical Rescarch Unit
INEI – Malbrán
Protocolo de trabajo
• Condiciones de corrida
Campylobacter
vs
Yersinia modificado
• Enzimas XbaI y NotI
• Aislamientos seleccionados
- 7 de cada serotipo de Shigella flexneri
- de brotes
Conclusiones preliminares
1º etapa
• Condición de corrida
protocolo Yersinia modificado
• Enzimas XbaI y NotI
1ª enzima NotI
?
2ª enzima XbaI
Ventajas y
Desventajas
• Buena discriminación de aislamientos asociados
a brotes
Ejemplos: XbaI-PFGE
Shigella flexneri 1, digeridas con XbaI con el protocolo de Campylobacter sp vs Yersinia modificado
2
1
3
4
5 6 7
1
2
3
4
5
6
7
Protocolo Campylobacter
Protocolo Yersinia modificado
6,8 a 35,4 seg
1,8 a 25 seg
Ejemplos: NotI-PFGE
Shigella flexneri 1, digeridas con NotI, con el protocolo de Campylobacter sp vs Yersinia modificado
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
Protocolo Campylobacter
Protocolo Yersinia modificado
6,8 a 35,4 seg
1,8 a 25 seg
Desarrollo de
protocolo estandarizado de PFGE
para incorporación de
Enterobacter sakazakii a PulseNet
Enterobacter sakazakii
Antecedente
2006: PFGE de 22 aislamientos con la condición de corrida
de Shigella sonnei enzima XbaI
Resultados a mejorar
Condición de corrida: Yersinia modificado enzima XbaI
Enterobacter sakazakii 2007
Resultados preliminares
XbaI-PFGE
1 2 3
4 5 6 7
8 9 10 11
1 2 3 4
5 6 7 8
9 10 11
Protocolo Shigella sonnei
Protocolo Yersinia modificado
2,2 a 54,2 seg
1,8 a 25 seg
Enterobacter sakazakii
Plan de trabajo 2007-2008
• Continuar el estudio de todos los aislamientos
existentes en la colección de cultivos del INEI (n=22)
- condiciones Yersinia modificado
- enzimas XbaI y otra a elegir
• Realizar el análisis y comparación de los resultados con
los dos protocolos (Shigella sonnei y Yersinia
modificado)
• Discutir los resultados en el Comité Ejecutivo de
PN-Internacional
• Seleccionar método
• Validar
Modificaciones del
protocolo estandarizado de PFGE
para Salmonella sp., Shigella sonnei
y E. coli O157
23 al 25 de octubre 2007
Angela Salve
Principales Modificaciones
• DO de las suspensiones bacterianas
DO de 1.0 a 610 nm
• NO AGREGAR SDS al 1% en la agarosa utilizada en la
preparación de los “plugs”.
• Se puede usar una menor cantidad de enzima por “plug”
(20 - 30 U)
Utilización de Tiourea en cepas
No Tipificables
Cepas No Tipificables
Hay aislamientos que muestran ADN degradado en
el gel y se consideran no tipificables por PFGE
•
Ejemplos: algunas cepas de E. coli O157 y no O157; ciertas serovariedades de
Salmonella, como Derby, Livingston, Ohio, Panama, Saintpaul y Cerro (donde
todos los aislamientos pueden ser no tipificables) o algunas cepas de ciertas
serovariedades tales como Newport, Miami y otras, que generalmente se pueden
tipificar por PFGE
El agregado de 50 μM de tiourea en el buffer de
corrida previene la degradación de ADN
Ejemplo de la Utilización de Tiourea
Salmonella Cerro
Sin Tiourea
Con Tiourea
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