lab.
Aspectos a tener en cuenta en el análisis de
residuos de plaguicidas en vegetales por
LC/MS/MS
F. Mocholí
Seminarios ABI, Noviembre 2007
lab.
Tiempos Pasados
 Costosa preparación de la muestra para conseguir extractos
muy limpios
 Evitar contaminación cromatográfica
 Mantener el sistema inerte
 Maximizar sensibilidad y obtener la máxima selectividad
 Pobre selectividad/sensibilidad en HPLC (tecnología de
columnas, detector UV detector, Derivatizar y detector de
Fluorescencia)
 Difícil confirmación (mala selectividad en HPLC)
 Se han llevado a cabo diferentes estrategias para conseguir
mejoras
2
Tiempos pasados
lab.
Smash the vegetable
sample (50g)
+60ml EtOAc + 13g Na2SO4
Homogeneize (20sec)
Filter
+60ml EtOAc + 13g Na2SO4
Homogeneize (20sec)
Evaporate
SPE/GPC
Evaporate
Reconstitute with 5ml
Cyclohexane
10 fold concentration
3
lab.

Distintas técnicas para
distintos compuestos (UV,
derivatización para
Fluorescencia, etc.)

Pobre selectividad (longitud
de onda, espectro UV)

Baja sensibilidad

Limitado número de
compuestos

Duración de los
cromatogramas
Tiempos pasados
DAD, 2mg/Kg standard
4
GC-LC/MS Polaridad/Peso Molecular
lab.
Ionic
Analyte Polarity
LC/MS Ionspray
GC/MS
Non-Ionic
101
102
103
10
104
105
Molecular Weight
5
lab.
Evolución de LC/MS
 Necesidad de confirmación por MS
 Número de analitos en aumento
 Gran esfuerzo en interfases (sensibilidad, robustez)
 Avances en in tecnología de columnas (resolución, tiempo
de análisis), sistemas de HPLC (inyección, volumen muerto,
presión, etc.)
 La ionización en LC/MS solo da 1 ion
MS/MS
 Elección entre tecnologías (Trap, Triple Quad, etc.)
 Número de analitos en aumento
 Identificación de desconocidos
 Número de analitos en aumento
6
lab.
Ionización por Electrospray
7
lab.
Ion Spray (ESI)
8
lab.
Ion Spray (ESI)
9
lab.
Ion Spray (ESI)
10
lab.
Ion Spray (ESI)
11
lab.
Fuentes de ionización para ESI
 Electrospray
 hasta 1 ml/min
 Dependiente de la Concentración
 Ionspray (Electrospray asistido neumáticamente)
 Flujos de líquido 5-200 ul/min
 Mejor sensibilidad que electrospray en este intervalo de flujos
 Dependiente de la Concentración
 TurboIonSpray (Ionspray con gas de secado caliente)
 Flujos de líquido 5-1000 ul/min
 Mejor sensibilidad que ionspray en este intervalo de flujos
 Dependiente de la Concentración
 Fuente Turbo V (TurboIonspray con doble calefactor y dinámica de los gases)
 Flujos de líquido 5-2000 ul/min
 Mejor sensibilidad que turboionspray en este intervalo de flujos
 Comportamiento dependiente de la masa en algunos intervalos de flujos
lab.
Estrategias para mejorar la robustez
Problema: Baja tolerancia o intolerancia a sustancias poco
volátiles
Solución:
Hacer que los iones describan un camino má o menos
tortuoso (Balance entre sensibilidad y robustez)
Off axis
Pepperpot
Orthogonal
Crossflow
LCZ
aQa
13
Estrategias para mejorar la robustez
lab.
OSA
Angle
N2
N2
TurboIonSpray®
Turbo V source®
14
lab.
ESI: Mecanismo supresión iónica
Supresión Iónica  Reducción señal Analito
 Pares iónicos
 Evite reactivos que puedan formar pares iónicos fuertes con los iones
deseados y puedan neutralizar los iones en disolución. (Se reduce la
evaporación de los iones)
 Efectos competitivos durante la evaporación de los iones
 Alta concentración de iones de carga similar en la matriz, tampones, etc.
compiten en el proceso de evaporación iónica en las microgotas.
15
lab.
Supresión señal iónica
Menos señal a mayor
concentración del tampón
16
lab.
Comparación matrices Vegetales full scan
Lechuga
Naranja
Uva
17
lab.
Efecto Matriz
Columna 5 cm
Columna 15 cm
Lechuga 0.010mg/Kg
Uva 0.010 mg/Kg
18
lab.
MS/MS
Fuente
Ioniz.
Q1
Q2
Q3
SIS
CID
FULL SCAN
Fuente
Ioniz.
19
¿Qué “Dwell time” debo utilizar?
1 transición MRM (1 compuesto)
lab.
X
Como media, se requieren 15 puntos (o al
menos 10) para integrar con precisión un
pico cromatográfico
XX
X X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
30 segundos
(Anchura del pico)/(número de puntos)=
30/15 = 2 segundos
Se necesita 1 punto cada 2 segundos
(2000 ms)
20
¿Qué “Dwell time” debo utilizar?
2 transiciones MRM (1 compuesto Cuant y Cual)
lab.
Si “dwell time” permanece constante;
el tiempo para cada compuesto es
2000 ms:
2000 ms
+ 2000 ms
----------2 compuestos:
4000 ms
X
X
X
X
X
X
X
X
30 segundos / 4000 ms
= 7.5 puntos sólo!
X
X X
XXX
X
XXXXXXXXX X X X X X X X XX
30 segundos
21
¿Cómo determinar el máximo número de MRMs
que se pueden monitorizar simultáneamente?
lab.
Anchura de pico 30 s

“Dwell time” constante
=> El número de puntos para definir el pico cae rápidamente
Time
MRM
Puntos
2000
1
15
2000
2
7
2000
3
5
 Número de puntos por pico constante
=> “Dwell time” debe disnimuir!
Dwell time (ms)
MRM
Puntos
3DTrap
QqQ
2000
1
15
Sí
Sí
1000
2
15
Sí
Sí
667
3
15
Sí
Sí
200
10
15
Sí/No
Sí
100
20
15
No
Sí
10
200
15
No
Sí
22
¿Cómo determinar el máximo número de MRMs
que se pueden monitorizar simultáneamente?
lab.
Anchura de pico 10 s
Para 10 puntos por pico cromatográfico
=> “Dwell time” debe disminuir!
Dwell time (ms)
MRM
Data points
3DTrap
QqQ
1000
1
10
Sí
Sí
500
2
10
Sí
Sí
333
3
10
Sí
Sí
100
10
10
Sí/No
Sï
50
20
10
No
Sí
10
100
10
No
Sí
5
200
10
No
Sí
23
Prueba Columnas LC/MS. Analitos
lab.
Acephate
Demeton-S-methyl sulfoxide
Imazalil
Omethoate
Acetamiprid
Dichlorvos
Imidacloprid
Oxamyl
Aldicarb
Diflubenzuron
Indoxacarb
Picoxystrobin
Aldicarb Sulfone
Dimetomorph
Linuron
Propoxur
Aldicarb Sulfoxid
Diuron
Lufenuron
Pyraclostrobin
Benfuracarb
Ethiofencarb sulfone
Methamidophos
Spiroxamine
Carbendazim
Ethiofencarb sulfoxide
Methiocarb
Tebufenocide
Carbofuran
Fenhexamid
Methiocarb sulfone
Thiametoxam
Carbofuran 3OH
Fludioxonil
Methiocarb sulfoxide
Thicloprid
Carbosulfan
Flufenoxuron
Methomyl
Trifloxystrobin
Clofentezine
Hexaflumuron
Monocrotophos
Total analytes, 43
24
lab.
Columnas Probadas
 Atlantis T-3 (Waters), 100 mm, 2.1 mm, 3mm
 Hypersil Gold (Thermo), 100 mm, 2.1 mm, 3mm
 Hypersil Gold aQ (Thermo), 100 mm, 2.1 mm, 3mm
 QS Strategy 3RP (Interchim), 100 mm, 2.0 mm, 3mm
 Polaris C18 A (Varian), 100 mm, 2.0 mm, 3mm
 Ascentis RP-Amide (Supelco), 100 mm, 2.1 mm, 3mm
 Ascentis Express C18 (Supelco), 100 mm, 2.1 mm, 2.7mm
 Sinergy Hydro (Phenomenex), 100 mm, 2.0 mm, 2.5mm
Cada columna tiene su codigo individual en los datos siguientes
25
LC/MS Columns Linearity Test
lab.
40
38
37
37
37
35
34
33
30
29
30
25
20
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Número de compuestos con r2>0.99
6 diferentes concentraciones desde 0.001 a 0.200 mg/Kg,
3 replicas por concentración (18 inyecciones).
26
Prueba de anchura de pico LC/MS
lab.
 Anchura de pico (anchura a mitad de altura) en segundos
 Leyenda:
 Muy Ancho
 Ancho
 Bueno
Estrecho (muy bueno)
 Todos los cromatogramas tienen la misma achura (2 min)
27
lab.
RT
Analyte
Prueba de anchura de pico en columnas LC/MS
1
2
3
4
5
6
7
8
2.72
Methamidophos
27
37
18
18
16
28
24
20
4.77
Acephate
25
35
15
28
33
30
38
17
5.24
Omethoate
27
38
8
27
28
26
9
9
5.46
Aldicarb Sulfoxid
12
10
6
9
13
9
8
8
5.65
Aldicarb Sulfone
8
8
6
7
10
8
7
8
5.74
Oxamyl
8
7
6
6
9
6
7
6
5.87
Carbendazim
9
10
8
10
12
9
10
9
5.92
Demeton-S-methyl sulfoxide
8
8
7
8
7
7
8
7
6.01
Methomyl
6
6
7
6
8
7
8
6
6.11
Thiametoxam
4
4
4
4
4
4
4
4
6.29
Monocrotophos
7
7
6
7
7
6
6
8
6.61
Ethiofencarb sulfone
7
6
6
7
7
6
6
6
6.72
Imidacloprid
5
5
5
5
5
5
6
5
6.73
Ethiofencarb sulfoxide
7
7
7
9
5
7
6
6
6.94
Methiocarb sulfoxide
6
5
6
6
6
6
6
6
7.16
Carbofuran 3OH
6
6
6
7
6
6
6
7
7.20
Acetamiprid
7
7
7
8
7
7
8
8
7.37
Methiocarb sulfone
6
6
6
7
6
6
6
7
7.65
Thicloprid
7
6
7
7
6
7
7
7
8.13
Aldicarb
6
5
6
6
5
6
6
6
8.73
Dichlorvos
7
6
6
7
6
7
7
7
8.77
Imazalil
6
8
6
8
7
6
9
7
28
lab.
LC/MS Columns Peak Width Test
RT
Analyte
1
2
3
4
5
6
7
8
8.85
Propoxur
7
7
7
7
6
7
6
8
8.90
Carbofuran
8
6
7
8
7
8
9
6
9.58
Spiroxamine
8
9
11
11
22
6
20
9
9.95
Diuron
6
7
7
8
6
7
7
9
10.40
Linuron
7
7
6
6
6
5
6
7
10.50
Methiocarb
7
6
5
6
5
5
7
7
10.60
Dimetomorph
22
22
16
18
9
23
23
21
10.60
Fludioxonil
4
3
3
4
3
12
4
5
11.00
Fenhexamid
5
4
5
6
5
6
5
5
11.20
Diflubenzuron
6
5
5
6
8
6
5
5
11.20
Picoxystrobin
7
5
7
6
7
7
6
8
11.30
Tebufenocide
6
5
7
7
6
7
6
7
11.60
Pyraclostrobin
7
6
7
8
6
6
8
7
11.70
Clofentezine
6
6
6
4
10
7
7
8
11.80
Indoxacarb
5
5
4
6
6
5
4
5
11.90
Trifloxystrobin
7
5
7
8
6
8
6
6
12.00
Hexaflumuron
4
4
4
5
4
4
4
4
12.20
Benfuracarb
5
5
5
5
5
5
5
5
12.30
Lufenuron
4
6
3
5
4
4
12
5
12.50
Flufenoxuron
5
5
6
7
7
6
5
5
13.00
Carbosulfan
3
3
4
4
2
5
6
4
29
Methamidophos 0.100 mg/Kg
lab.
1
2
3
4
5
6
7
8
30
Acephate 0.100 mg/Kg
lab.
1
2
3
4
5
6
7
8
31
Omethoate 0.100 mg/Kg
lab.
1
2
3
4
5
6
7
8
32
Oxamyl 0.100 mg/Kg
lab.
1
2
3
4
5
6
7
8
33
+Hexaflumuron 0.100 mg/Kg
lab.
1
2
3
4
5
6
7
8
34
lab.
Tecnologías MS
Trap 3D
Sensibilidad
Full Scan
MS3
Q TRAP
(o más)
QqQ
Sensibilidad MRM
Pérdida de Neutros
Barrido de
Precursores
Sensibilidad Full
Scan
MS3
Sensibilidad MRM
Pérdida de Neutros
Barrido de
Precursores
35
lab.
Adquisición Dependiente de la Información (IDA)
Búsqueda de desconocidos
Barrido de MRM
 Barrido en “Multiple Reaction
Monitoring” de cientos de compuestos
(solamente 1 transición por analito...)
 Criterio IDA (umbral...)
 Adquisición automática de espectros
en modo “Enhanced Product Ion
Scans” en la trampa
Umbral de señal
Exclusión Dinámica
 Sustracción de Fondo Dinámica y
Exclusión Dinámica
 Búsqueda en bibliotecas de espectros
Scans dependientes
36
lab.
Metalaxil en uva
Library CE=20V
CE=20V
Fit
0.956
RFit
0.956
Purity 0.955
Library CE=35V
CE=35V
Fit
0.953
RFit
0.955
Purity 0.951
Library CE=50V
CE=50V
Fit
0.735
RFit
0.618
Purity 0.607
Metalaxyl 0.009 mg/kg (0.010 mg/kg LMR en alimento infantil) 37
lab.
Conclusiones
A través de los últimos años, se han desarrollado nuevas tecnologías en
LC/MS (Interfases ESI, columnas, Triple Quadrupolo, MS/MS, sistemas
más rápidos, Híbridos, etc.) permitiendo:
 Una disminución increíble en los límites de detección
 Aumento en el número de compuestos en un único análisis
 Gran Selectividad
 Preparación de la muestra más sencilla
 Inequívoca confirmación espectral, full scan MS/MS o
 Robustez del método que hace más fácil el trabajo en rutina de un
laboratorio de plaguicidas.
Y la historia continua...
38
lab.
lab.
Descargar

Organophosphorous Pesticides Analysis in Vegetables by …