The Shortest Telomere, Not Average
Telomere Length, Is Critical for Cell
Viability
and Chromosome Stability
Michael T. Hemann, Margaret A. Strong,
Ling-Yang Hao, and Carol W. Greider
Presentación:
Cinalli, Alejandro
Holgado, María Pía
Salvatierra, Damiana
Scazzina, Brenda
Telómeros
• Son estructuras especializadas presentes
en las terminaciones naturales de los
cromosomas, que permiten la estabilidad
cromosómica (Repetición TTAGGG)
• Mantienen su longitud por un equilibrio
acortamiento-elongación.
¿Qué determina la pérdida de
función telomérica?
En ausencia de telómeros con un largo
adecuado se observan fusiones
cromosómicas (final con final), arresto del
ciclo celular y apoptosis en células
germinales (infertilidad).
¿Qué dispara la respuesta celular?
Dos hipótesis:
• El promedio de la longitud telomérica
• El telómero más corto
OBJETIVOS
Determinar si la respuesta celular se dispara
por un promedio de longitud telomérico
bajo, o si se debe a la presencia individual
de telómeros muy cortos.
Modelo animal
• mTR = murine telomerase RNA (templado
para la síntesis del telómero)
Ratones mTR -/no presentan el RNA que sirve como templado
no tienen actividad telomerasa
Inicialmente (G1) no presentan fenotipo, en generaciones más tardias (ej: G4) los
telómeros son más cortos y hay eventos de fusión
Los telómeros cortos inician una
rta celular en ratones mTR -/mTR-/- (G6)
Telómeros cortos
mTR-/- (iF1)
mTR +/-
X
mTR+/- (iF1)
50% tel largos
50% tel cortos
TUNEL - TdT- mediated dUTP nick end
labelling
Apoptosis
Daño al DNA- roturas de cadenas por cortes con
endonucleasas
TdT transfiere dUTP biotinilado
Detección por streptoavidina-HRP
Incubación con DAB
mTR+/- y mTR-/- G3 no muestran
infertilidad y sus niveles de apoptosis de
células germinales o fusión de
cromosomas son los de un wild-type.
mTR-/- G6 es generalmente no fértil
•mTR-/- (iF1) presentó valores similares a los de un
mTR-/- G6.
•mTR+/- (iF1) mostró los mismos resultados que un
wild-type.
•Esto indica que el agregado de la telomerasa
“rescató” a este fenotipo. Y que la respuesta celular
se debe a la presencia de telomeros cortos.
Elongación preferencial de
telómeros cortos en ratones
mTR+/- (iF1)
• Se comparó la distribución de longitudes de los
telómeros de mTR+/- (iF1) y mTR-/- (iF1), con
mTR+/-, mTR-/- G3 y mTR-/- G6 usando
Q-FISH.
• La longitud del telómero esta representada
como unidades teloméricas fluorescentes
(TFUs).
• El resultado se expresó como distribución de
frecuencias de TFUs.
Q-FISH
• Mide el largo individual de los telómeros
• Células arrestadas en metafase teñidas con sonda
fluorescente específica de telómeros.
• Tinción con DAPI para visualizar cromosomas.
• Medición cuantitativa de la señal fluorescente para
determinar largo de telómeros.
• Se ve un cambio significativo
en el promedio entre mTR+/y mTR-/- G3. Pero la
diferencia fue mínima entre
mTR -/- G3 y los mTR (iF1s).
• Entre mTR+/- (iF1) y mTR-/(iF1) se vio una diferencia en
el número de telomeros muy
cortos.
• Esto mostraría que la función
telomérica se restaura por la
adición de repeticiones a los
telómeros mas cortos y no
por una elongación global.
La restitución de la actividad de
telomerasa ocurre temprano en el
desarrollo
Fibroblastos embrionarios (MEFs) de
ratones mTR -/- (iF1) y +/- (iF1) de 13,5
días de gestación.
% de terminaciones
de telómeros sin
repeticiones
teloméricas (signal
free ends)
Análisis citogenético:
número de fusiones
por metafase
Estudio de la sensibilidad a la radiación ionizante
- Irradiar con Cs137  radiación beta y gamma
- Medir % viabilidad con azul de tripan
La telomerasa restituye las
repeticiones en los +/Probablemente la telomerasa sea dirigida
específicamente a telómeros cortos y
disfuncionales
¿Reclutamiento por proteínas
ausentes?
¿Reclutamiento por
proteínas que reconocen
telómeros disfuncionales?
Existe una distribución no azarosa de
las fusiones entre cromosomas en
una línea de ratones mTR -/• SKY
(Spectral Karyotype- Cariotipo espectral en colores)
• Q-FISH
(Quantitative fluorescence in situ hybridization)
SKY
- Análisis de todos los cromosomas
de un organismo simultáneamente,
cada uno de ellos se encuentra
marcado con un color diferente
- Se usan sondas de DNA
fluorescentes que emiten
entre los 200 y 700 nm
- La discriminación por el
color se consigue por medio
del análisis espectral de las
señales fluorescentes
SKY (Spectrl Karyotype) en esplenocitos de mTR -/-
SKY – Fusión de
cromosomas 19 por
los brazos P
Tinción con DAPI
(4',6-diamino-2-phenylindole)
Cromosoma 19: 12 de 14
Cromosoma 5: 10 de 14
Cromosomas 3, 9, 10 e Y: sin eventos de fusión
Los cromosomas que frecuentemente están
involucrados en fusiones son los de telómeros
más cortos
Metafases de
mTR-/- G6
Q-FISH
Para determinar qué
telómeros no emitían señal
SKY
Para determinar la identidad
de los cromosomas
Los cromosomas que frecuentemente están
involucrados en fusiones son los de telómeros
más cortos
Análisis
estadístico
Un cromosoma con extremo libre de señal tiene
mayor probabilidad de fusión que un cromosoma
conteniendo repeticiones teloméricas
Los cromosomas que frecuentemente están
involucrados en fusiones son los de telómeros
más cortos
El telómero más corto es el más propenso a
perder función y sufrir fusión con otro telómero corto
Esto sugiere que es necesaria la presencia de dos telómeros
cortos para que se dé un evento de fusión en la célula
Estudios en células humanas
El telómero en
17p es
normalmente
más corto que
los otros
El cromosoma 17 podría estar
involucrado más frecuentemente en
rearreglos
La ubicación de p53 en 17p contribuiría a la
frecuente pérdida de p53 en los tumores
humanos
No hay secuencia telomérica presente en las
uniones de la fusión en ratones mTR-/- G5-G6
Estudios previos
Repeticiones satélite
Repeticiones teloméricas
Repeticiones satélite
No hay secuencia telomérica presente en las
uniones de la fusión en ratones mTR-/- G5-G6
Clonado por PCR de la zona de la fusión
Wild-type
No se generaron
productos
específicos
mTR-/- G5-G6
Se generaron
productos
específicos
Secuenciación
La unión consistía en 2
pequeñas secuencias
satélite fusionadas
directamente
No hay secuencia telomérica presente en las
uniones de la fusión en ratones mTR-/- G5-G6
Ninguna unión mostró
secuencias de
repetición telomérica
Todas mostraron secuencias
de microhomología
Características de eventos de fusión
dados por mecanismos NHEJ
(non-homologous end joining)
No hay secuencia telomérica presente en las
uniones de la fusión en ratones mTR-/- G5-G6
FISH
Sonda específica para
repeticiones
satélite pequeñas
de ratón
Todas las fusiones
mostraron una
señal disminuida
en relación a
satélites normales
Una línea independiente de ratones mTR -/presenta diferentes telómeros cortos y
diferentes fusiones cromosómicas.
• Cada línea se establece por eventos al azar
durante la fertilización inicial.
• La distribución de telómeros cortos vs las
fusiones observadas no fue azarosa,
¿ocurre lo mismo en otras líneas?
Linea 2
El resultado es una distribución no azarosa de longitudes
teloméricas respecto de las fusiones pero los cromosomas
cortos involucrados son distintos.
Las longitudes teloméricas en
ratones wild-type no son
cromosoma específicas.
• SKY y Q-FISH: distribución de las longitudes
teloméricas para cromosomas individuales.
• Análisis estadístico: comparación entre la
distribución longitudes de cada telómero y
las demás distribuciones para el resto de los
cromosomas.
No hay ningún final cromosómico que tenga una distribución
de longitudes teloméricas cortas más reproducible que otros
telómeros en ratones wild-type.
Conclusión:
• No es la longitud promedio de los
telómeros la que gatilla la respuesta
celular, sino la presencia de telómeros
individuales con longitudes muy cortas.
• La presencia de telomerasa
rescata los fenotipos con
telómeros disfuncionales.
• El rol esencial de la telomerasa no sería el
mantenimiento del promedio del largo de
los telómeros, sino el mantenimiento de la
función de los mismos, cuando alcanzan
un largo mínimo crítico.
• No hay telómeros que presenten
tendencia a ser más cortos, pero sí
los telómeros más cortos originan
fusiones cromosómicas (final con
final).
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The Shortest Telomere, Not Average Telomere Length, Is