DISTINTOS MECANISMOS QUE
PRODUCEN DISFUNCIÓN
TELOMÉRICA
 Mutaciones en proteínas de unión al telómero


Mutaciones en la telomerasa
Acortamiento del telómero
DESENCADENAN SIMILARES RESPUESTAS
CELULARES:
 Fusión cromosómica
 Arresto del ciclo celular
 Apoptosis dependiente de p53
TELOMERASA
Transcriptasa inversa que añade repeticiones
teloméricas al final de los cromosomas para
compensar la pérdida de secuencias que se
produce durante la replicación del DNA.
Su ausencia provoca el acortamiento paulatino del
telómero.
El progresivo acortamiento desencadena la
pérdida de función telomérica.
ACORTAMIENTO DE LOS
TELOMEROS
CONSECUENCIAS DE LA
AUSENCIA DE TELOMERASA
 Generar especies de ratones Knock
telomerasa mTR -/-
out
Blasco et al 1997
RATONES Knock out mTR -/Para generar ratones deficientes en la actividad de la
telomerasa se delecionó la copia del gen ARN telomerasa
(mTR) de la línea germinal.
Mediante Southern blot se determinó la presencia de una
única copia del gen.
Para delecionar el gen mTR se construyó el plásmido
pPNT-mTRΔ, el que reemplazó el gen mTR completo con
un gen de resistencia a la neomicina.
Los ratones mTR-/- carecen de actividad detectable de la
telomerasa aunque fueron viables por seis generaciones.
Gene
Replacement and
Transgenic
Animals
AUSENCIA DE TELOMERASA
GENERACIONES DE RATONES mTR -/(Gen de la telomerasa Knock out)
G1
•Telomeros normales
•Fenotipo WT
G3
•Telomeros cortos
•Fenotipo WT
G6
•Telomeros muy cortos
•Fusion de los extremos de los cromosomas
•Apoptosis de células germinales
•Alta tasa de infertilidad
OBJETIVO GENERAL
Establecer si para la viabilidad celular y la
estabilidad cromosómica es determinante
el largo promedio de los telómeros
o el acortamiento crítico de los mismos
Apoptosis por una
disminucion del
largo promedio de
los telomeros
Apoptosis por un
acortamiento crítico del
telomero de un
cromosoma
PRIMER EXPERIMENTO
Los telómeros cortos
inician la respuesta
celular en mTR-/-
2 NUEVAS GENERACIONES
mTR +/-
mTR -/- (G6)
TELOMEROS LARGOS
TELOMEROS CORTOS
CON TELOMERASA
SIN TELOMERASA
mTR +/- (iF1)
50 % TELOMEROS CORTOS
CON TELOMERASA
50% TELOMEROS LARGOS
mTR -/- (iF1)
SIN TELOMERASA
Comparación de los fenotipos
Peso testicular.
Apoptosis testicular
Fusión de cromosomas en
metafase de leucocitos
WT mTR+/- : Con telomerasa. 100% telómeros largos “PARENTAL”
G3 mTR-/- : Sin telomerasa. 100% telómeros cortos
G6 mTR-/- : Sin telomerasa. 100% telómeros muy cortos “PARENTAL”
iF1 mTR-/- : Sin telomerasa. 50% telómeros cortos, 50% telómeros largos
iF1 mTR+/- : Con telomerasa. 50% telómeros cortos, 50% telómeros largos
G6 mTR-/- : Sin telomerasa. 100% telómeros muy cortos “PARENTAL”
iF1 mTR-/- : Sin telomerasa. 50% telómeros cortos, 50% telómeros
largos
WT mTR+/- : Con telomerasa. 100% telómeros largos “PARENTAL”
G3 mTR-/- : Sin telomerasa. 100% telómeros cortos
iF1 mTR+/- : Con telomerasa. 50% telómeros cortos, 50% telómeros
largos
CONCLUSIÓN
La presencia de telómeros cortos es
suficiente para desencadenar una
respuesta celular
La adición de la telomerasa
rescata el fenotipo W-T
SEGUNDO EXPERIMENTO
¿EXISTE UNA ELONGACIÓN
PREFERENCIAL DE LOS TELOMEROS
CORTOS POR LA TELOMERASA EN
RATONES mTR +/- (iF1)?
Se realiza una comparación de la
distribución del largo de los telomeros
en cada genotipo.
WT mTR+/- , G3 mTR-/- , G6 mTR-/- , F1
mTR-/- , F1 mTR+/Se utiliza la técnica de Q-Fish
( Quantitative Fluorescence in situ hybridization)
para medir la cantidad de repeticiones teloméricas en cada cromosoma.
Q FISH
Es una técnica cuantitativa de hibridación
in situ por fluorescencia
Desnaturalizan e hibridan con una sonda
CCCTAA (secuencia telomérica) marcada radiactivamente
La intensidad de la fluorescencia en cada telómero es calculada desde
una camara digital utilizando técnicas de análisis de imagen.
El largo de los telómeros en cada genotipo está
representado como una distribución de frecuencia
de las intensidades de la señal (TFUs) expresadas
en unidades fluorescentes arbitrarias.
DISTRIBUCION DE FRECUENCIAS
DE LOS TFUs
Se observó un cambio significativo
en la longitud promedio de los
telomeros mTR +/- y los mTR -/- G3
Se observó una longitud promedio
similar mTR+/- i(F1) y mTR-/- i(F1)
Pero si existen diferencias
significativas en el numero de
repeticones teloméricas
CONCLUSIÓN
La telomerasa restaura la función
telomérica en los mTR+/- i(F1) por
adición de repeticiones sobre los
telómeros mas cortos
Y no por elongación global
TERCER EXPERIMENTO
SE INVESTIGA EN QUE FASE DEL DESARROLLO
OCURRE LA RESTAURACION DE LOS TELOMEROS
Utilizan fibroblastos embrionarios (MEF) de ratones de cada
genotipo para analizar:
A) Extremos libres de los cromosomas (son detectados por
Q-FISH como falta de señal telomérica)
B) Fusión de los cromosomas
C) Viabilidad de los MEF expuestos a radiación ionizante
en todos los genotipos.
MÉTODO
WT mTR+/+, G3 mTR-/-, G6 mTR-/-, F1 mTR-/-, F1mTR+/-
Toman 5 embriones de 13 días de cada
genotipo
Analizan 20 metafases de MEF en cada uno de los embriones
Sacan el Nº promedio de extremos libres y de
cromosomas fusionados para cada genotipo
EXTREMOS LIBRES EN LOS CROMOSOMAS (Q-FISH)
Análisis de las señales libres
en los extremos
cromosómicos
El número de extremos libres en
MFEs mTR-/- iF1 es
significantemente más elevado que
en mTR+/- iF1
F1i mTR-/- muestra un promedio de
1.34 cromosomas sin repeticiones
telomericas.
F1i mTR+/- muestra solo un
promedio de 0.02 cromosomas sin
repeticiones.
FUSIONES CROMOSOMICAS
Análisis Citogenético de
mTR+/- iF1 y de mTR-/- iF1.
mTR -/- iF1 presenta 0,27
cromosomas fusionados por
metafase
mTR+/- iF1 no presenta extremos
fusionados.
Del análisis de las señales libres en los extremos cromosómicos y citogenético
llevado adelante en cepas de diferente edad para los genotipos mTR+/- iF1 y
mTR-/- iF1 se puede concluir que la restauración de la función de los telómeros
ocurre antes del día13,5 del desarrollo.
Método para estudiar la viabilidad de los MEF despues
de exponerlos a radiación ionizante
WT mTR+/+, G3 mTR-/-, G6 mTR-/-, F1 mTR-/-, F1 mTR+/Toman 3 embriones de cada genotipo
De cada embrion se obtienen 2
cultivos independientes de MEF
Sin Irradiar
Se expone a dosis
crecientes de radiación
ionzante
Calculan el porcentaje de viabilidad
RESULTADO
Mientras que el WY, mTR-/G3 y mTR+/- iF1 MFEs
muestran niveles similares de
daño en su crecimiento,
mTR -/- iF1 MFEs y mTR-/G6 sufren una significativa
reducción en la supervivencia
celular
Existe una íntima relación entre la long de los telómeros y la
sensibilidad a la RI. Los telómeros cortos presentan una
menor supervivencia frente a radiaciones ionizantes.
CONCLUSIÓN
La función de los telómeros ocurre
antes del día 13,5 del desarrollo.
Los telómeros cortos presentan una menor
supervivencia frente a radiaciones ionizantes
CUARTO EXPERIMENTO
Distribución no al azar de fusiones
cromosómicas
Generan dos líneas independientes de ratones
Knock Out mTR -/-
LÍNEA 1
14 individuos
y se analizan 26 metafases
de esplenocitos
LÍNEA 2
11 individuos
y examinan 54 metafases
LÍNEA 1
14 individuos
y se analizan 26 metafases
de esplenocitos
1) Identificar especificamente los
cromosomas que estan implicados en
las fusiones ( SKY)
Línea 1:
Cromosoma 19 fusionado en 12 de 14 ratones. No presentan señal
telomerica 9/9.Cromosoma 5 fusionado en 10 de 14 ratones. No
presentan señal 7/9 Cromosomas 3, 9, 10 e Y nunca estan fusionados.
CONCLUSIÓN
No hubo una fusión en particular que fuera
vista en todas las metafases de un ratón
dado , indicando que las fusiones ocurrieron
de novo y no fueron heredados de una
generación previa
Las fusiones son generalmente en los
brazos p
En esta linea los cromosomas mas
frecuentemente involucrados en fusiones son
el 19 y el 5
QUINTO EXPERIMENTO
Chromosomes Frequently
Involved in Fusions Have the
Shortest Telomeres
Objetivo: Determinar si la presencia de telómeros
cortos esta relacionado con los eventos de fusión
cromosómica.
Se analizan esplenocitos de ratones mTR-/- (sin telomerasa),
de generaciones tardías G4-G6 (mayor frecuencia de
fusiones)
Cromosomas analizados mediante
QFISH


Ratones Wild –Type analizados muestran una señal en
cada extremo telomérico.
Ratones mTR-/- (G4-G6), muestran un número
aumentado de cromosomas sin señal detectable.
Análisis de cromosomas mediante
SKY Fish (spectral karyotyping).




Utiliza combinación de 24
sondas coloreadas, y
fluorocromos distinguibles
por espectro de color.
Se obtienen diferentes
combinaciones de color por
La mezcla de diferenctes
fluorocromos.
Asigna a cada cromosoma
un color específico.
En este caso identifica qué cromosoma
perdió su señal telomérica
Resultados



Cromosoma 19 perdió la señal telomérica en 9/9
ratones examinados.
Cromosoma 5 perdió su señal en 7/9 ratones
examinados.
Análisis estadístico para establecer la aparente
relación entre cromosomas sin señal de
telómero y eventos de fusión.
(en comparacion con probabilidad de que cada
cromosoma se involucre en evento de fusion al
azar).=cromosomas sin señal telomerica tienen
mayor probabilidad de evento de fusión.
CONCLUSIÓN
Cromosomas con telómeros muy cortos
( que perdieron la señal telomérica), son los
más propensos a sufrir fusión.

SEXTO EXPERIMENTO
Análisis de las fusiones
cromosómicas que causan
disfunción telomérica.
Analizan la secuencia nucleotídica que
comprende la fusion de los cromosomas
Clonaron y secuenciaron empalmes de fusión.
Realizan una PCR utilizando primers que hibridan
con las secuencias de los minisatélites
Amplifican DNA de esplenocitos de ratones WT y mTR -/- (G5 y G6)
El ensayo en WT no
genera producto
Se generan bandas específicas
Secuencian el producto de PCR
El amplicón está compuesto sólo por repeticiones
de los minisatélites
Utilizan Q-FISH dirigido a los
minisatélites para determinar si
todas las fusiones se originaban
por mecanismos similares
Analizan 30
metafases
de 2 ratones
Secuencia amplificada por PCR
Conclusiones





Las fusiones se producen directamente en los
minisatélites mediante mecanismos NHEJ (nonhomologous end joining).
Las fusiones no contienen repeticiones
teloméricas.
Todas las fusiones mostraron una disminución
en la intensidad de la señal en relación al valor
promedio del total de las señales normales
(Rango= 2,5%-55%).
El promedio de disminución de la señal fue del
21%.
Esta pérdida de secuencias en los minisatélites
sugiere la ausencia de regiones teloméricas en
estas uniones.
SÉPTIMO EXPERIMENTO
UNA LÍNEA (LÍNEA 2) M TR -/- INDEPENDIENTE
TIENE DISTINTOS CROMOSOMAS CON
TELÓMEROS CORTOS Y DIFERENTES
CROMOSOMAS FUSIONADOS.
Objetivo
Observar si el evento fundador de un clon, contribuye con la
distribución no al azar de telómeros cortos
(C) Frecuencia de fusiones en cada
cromosoma de la línea 2 de ratones.
(SKY)
(D) Frecuencia de señal de extremos
de cromosomas libres en cada
cromosoma de la línea 2 (Q-FISH)
Visualizamos la distribución no al
azar de fusiones y se observa que:
Los cromosomas fusionados eran más
frecuentemente los que tenían
telómeros cortos, sin embargo, la
identidad de éstos era distinta a los de
la línea 1 de ratones.
CONCLUSIÓN
 No existe ningún cromosoma
en particular que presente los
telómeros mas cortos o mas
largos en los ratones examinados
OCTAVO EXPERIMENTO
¿EL LARGO TELOMÉRICO EN RATONE W-T
ES CARACTERISTICO DE CADA
CROMOSOMA?
Este análisis pretende establecer si alguna
distribución telomérica es significativamente
mas corto o mas larga que las otras
distribuciones teloméricas
OBJETIVO
Determinar la distribución del largo de los
telómeros en cada cromosoma de ratones WT utilizando la técnica de SKY y Q Fish.
Los datos son analizados por un método
estadísitco
METODO
 Toman 5 ratones Wild Type
 Analizan 20 metafases de esplenocitos de cada ratón
 Cuantifican el largo de los telómeros por Q-FISH e
identifican a cada cromosoma por SKY
 Es determinada la distribución del largo de los
telómeros para cada cromosoma
 La distribución del largo de los telómeros en cada
brazo del cromosoma fue comparado con la
distribución de todos los otros brazos de los
cromosomas en cada ratón
C) Tabla final de todos los resultados
obtenidos por el test estadístico
Wilcoxan rank sum
De los 5 ratones nombrados como
A, B, C, D y E.
• Los círculos azules representan
los telómeros significativamente más largos
• Los puntos rojos, los significativamente más
cortos.
• Los asteríscos representan los largos de los
telómeros que fueron solo escasamente
significativos
No hay ningún cromosoma en particular que tenga una distribución de
longitudes de telómeros más cortos o más largos en ratones WT.
CONCLUSIÓN
• Un acortamiento crítico de los telómeros en un cromosoma es
necesario y suficiente para producir los fenotipos vistos en las
generaciones tardías de los ratones mTR -/• Solo los cromosomas con telomeros cortos son los que están
implicados en las fusiones .
• La reintroducción de la telomerasa restauró las repeticiones
teloméricas en los cromosomas con telómeros cortos de los ratones
mTR +/- (F1).
• El rol de la telomerasa no es mantener el largo promedio de los
telómeros sino el de mantener la función telomérica en los
cromosomas que presenten telómeros cortos.
CONCLUSIONES FINALES
• Un acortamiento crítico de los telómeros en un cromosoma
es necesario y suficiente para producir los fenotipos vistos en
las generaciones tardías de los ratones mTR -/•Solo los cromosomas con telómeros cortos son los que están
implicados en las fusiones .
• La reintroducción de la telomerasa restauró las repeticiones
teloméricas en los cromosomas con telómeros cortos de los
ratones mTR +/- (iF1).
• El rol de la telomerasa no es mantener el largo promedio de
los telómeros sino el de mantener la función telomérica en los
cromosomas que presenten telómeros cortos.
• Dos cromosomas disfuncionales pueden sufrir degradación
transitoria de sus extremos seguida de fusión cromosómica
por mecanismos de NHEJ en regiones minisatelitales.
Línea 1:
Cromosoma 19 fusionado en 12 de 14 ratones. No presentan señal
telomerica 9/9.Cromosoma 5 fusionado en 10 de 14 ratones. No
presentan señal 7/9 Cromosomas 3, 9, 10 e Y nunca estan fusionados.
Línea 2:
Cromosoma 6 fusionado en 6 de 14 ratones.
Cromosoma 19 fusionado en 3 de 14 ratones.
Cromosoma 5 no presenta fusión.
LÍNEA 1
14 individuos
y se analizan 26 metafases
de esplainocitos
LÍNEA 2
11 individuos
y examinan 54 metafases
1) Identificar especificamente los cromosomas que estan
implicados en las fusiones ( SKY)
2) Analizar si la presencia de telomeros cortos está
correlacionada con la fusión de los cromosomas (QFISH)
Metafase analizada por la técnica SKY
Identificacion de
cromosomas
fusionados
Metafase analizada por la técnica
DAPI
Metafase analizada por la tecnica Q-FISH
Identificación de
cromosomas con
extremos libres
Pérdida de la señal
telomérica
Control: analizan un Wild Type y ven que
muestra una señal en cada extremo del
cromosoma
Metafase analizada por la
tecnica SKY
Observación: Las mTR -/- van
incrementando el Nº de cromosomas que
no presentan señal en sus extremos al
incrementar las generaciones.
Los cromosomas implicados en
fusiones presentan frecuentemente
telomeros cortos
EXPERIMENTO CONTROL
¿El largo de los telómeros en ratones Wild
Type es característico de cada cromosoma?
Este análisis establece si alguna distribución telomérica
es significativamente más corta o más larga que las otras
distribuciones teloméricas
Hipótesis: Cada cromosoma tiene una distribución del largo de
los telómeros y en cada evento de fertilización se establece una
nueva distribución.
Determinan la distribución del largo de los telómeros en
cada cromosoma de ratones Wild Type utilizando la técnica
de SKY y Q-FISH. Los datos son analizados por el metodo
Wilcoxon´s Rank Sum (programa estadístico).
METODO
 Toman 5 ratones Wild Type
 Analizan 20 metafases de esplenocitos de cada ratón
 Cuantifican el largo de los telómeros por Q-FISH e identifican
a cada cromosoma por SKY
 Es determinada la distribución del largo de los telómeros
para cada cromosoma
 La distribución del largo de los telómeros en cada brazo del
cromosoma fue comparado con la distribución de todos los
otros brazos de los cromosomas en cada ratón
La identidad de los cromosomas que carecen de señal telomérica
se corresponde con la identidad de los cromosomas implicados
en fusiones
La identidad de los cromosomas difiere en las 2 líneas
Representa una distribución significativa de los telomeros mas largos
Representa una distribución significativa de los telomeros mas cortos
No existe ningun cromosoma en particular que presente los
telómeros más cortos o más largos en los ratones
examinados.
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ausencia de telomerasa