Tipos de HPLC
Intercambio Iónico
Es un método eficaz para la
separación y determinación
de iones.
Se basa en el uso de las
resinas e intercambio iónico.
Se desarolló cuando se
demostró que se podían
resolver fácilmente mezclas
de cationes o aniones
mediante las columnas de
HPLC rellenas con resinas
de intercambio catiónico o
aniónico.
Fundamento
En unas condiciones determinadas serán
retenidas en la columna las muestras que
tengan una carga complementaria a la de
la matriz del gel, siendo eluidas las
restantes.
Para eluir las muestras retenidas se puede
variar la carga iónica del solvente o su pH
de forma que se alcance el punto
isoeléctrico de la muestra de interés o el de
la matriz, neutralizando de este modo la
fuerza que retiene a la muestra en la
columna.
Rellenos/Resinas
Los procesos de intercambio
iónico se basan en los equilibrios
de intercambio entre los iones de
una disolución y los iones del
mismo signo que están en la
superficie de un sólido de elevada
masa molecular y esencialmente
insoluble.
Tipos de Resinas
Resinas de partículas
esféricas porosas,
copolimerización del
estireno y el
divinilbenceno.
Relleno de partícula
pelicular, sílice recubierto
Resinas basadas en
carbohidratos.
Intercambio Catiónico
Los sitios activos más comunes en las resinas de
intercambio catiónico son los grupos de ácido
sulfónico
un ácido fuerte y los grupos de
ácido carboxílico
un ácido débil.
Intercambio Catiónico
Cuando un intercambiador iónico de ácido sulfónico
se pone en contacto con un disolvente acuoso que
contiene cationes MX+ se establece un equilibrio de
intercambio que puede describirse por:
Intercambiador Catiónico
Intercambiadores Aniónicos
Los intercambiadores aniónicos contienen grupos
amino terciario
o amino primario
; los primeros son bases fuertes y los últimos bases
débiles.
Intercambiador Aniónico
De una forma semejante, un intercambiador de base
fuerte interacciona con los aniones Ax- según la
siguiente reacción.
Intercambiador Aniónico
Constante de Equilibrio
Se considera la reacción entre los iones de una sola
carga B+, con una resina de ácido sulfónico.
Cuando la K tiene un valor alto, la fase sólida tiene
una gran tendencia a retener los iones B+ y cuando K
es pequeña sucede lo contrario.
Cromatografía de Ión
Suprimido
Falta de un buen sistema de
detección universal. Se
solucionó con detectores de
conductividad pero se requiere
de una elevada concentración
de electrolito.
La columna supresora del
eluyente, está rellena con una
segunda resina de intercambio
iónico.
Un inconveniente de las
columnas supresoras es la
necesidad de regenerarlas
periódicamente.
Recientemente se dispone de
supresores de membrana que
operan continuamente.
Donde el eluyente y la
disolución supresora fluyen en
direcciones opuestas en ambos
lados de las membranas
permeables de intercambio
iónico.
Cromatografía Exclusión de
Iones
Tiene aplicaciones en la
identificación y determinación de
especies ácidas en distintas
muestras. Las sales de los ácidos
débiles se convierten en sus
correspondientes ácidos en
presencia de los protones del
intercambiador. También se puede
determinar por cromatografía de
exclusión de iones las bases débiles
y sus sales.
De Fase Ligada
Reemplazando el tipo común de unión de la fase
estacionaria a su soporte, haciéndola perdurable por
medio de una unión química covalente.
Factores que afectan la
retención
Fuerza iónica
pH: Sólo para intercambiadores, aniónicos o
catiónicos, débiles, ya que los fuertes están totalmente
disociados. Para aquellos se cumple:
Modificadores Orgánicos
Aplicaciones
La cromatografía de intercambio
iónico se ha aplicado a una gran
variedad de sistemas orgánicos y
bioquímicos incluyendo fármacos y
sus metobolitos, sueros, conservantes
de alimentos, mezclas de vitaminas,
azúcares
y
preparaciones
farmacéuticas.
Exclusión Molecular
Es una técnica de purificación muy utilizada y debido a
su sencillez y eficacia en la resolución de mezclas
complejas de macromoléculas. Es muy utilizada para
fines analíticos.
El volumen total (Vt), que es el volumen que ocupa el cilindro
de gel hidratado.
El volumen de vacío (Vo), o el volumen de agua existente entre
las esferas del gel (fuera de ellas).
El volumen ocupado por el agua en las esferas del gel (Vi), que
se expresa como la diferencia entre los dos volúmenes
anteriores: Vt-Vo-Vg
Principio
Las moléculas de muy pequeño
tamaño penetran en el interior de las
esferas que componen el gel y por lo
que no son extraídas de la columna
hasta que no ha pasado a través de
ella un volumen de líquido igual a su
volumen total (Vt)
Este tipo de cromatografía separa las sustancias en función de
dichos pesos moleculares, obteniéndose primero las más
pesada
Tipos de geles
Los geles utilizados como tamiz molecular son polímeros
hidrofílicos e insolubles cuyas cadenas poliméricas se
entrecruzan hasta formar una red tridimensional.
Los geles normalmente utilizados
son de tres tipos: dextrano
(SEPHADEX), agarosa y
poliacrilamida.
Estos geles se identifican por una
denominación de G-10 hasta G200.
Factores que pueden alterar la
separación
 Longitud de la columna.
 Flujo. Normalmente el flujo oscila entre 2 y 10 cm h-1.
 El volumen de la muestra a cromatografía. Debe ser iguale o
menor al 5% del volumen total.
 Empaquetado del gel en la columna. L
Medición de la exclusión
Se expresan en forma de gráficas (cromatograma)
donde se representa la cantidad de solutos en función
del volumen de líquido extraído de la columna.
Volumen de elución (Ve): Es volumen de líquido necesario
para extraer una determinada sustancia. El Ve de una sustancia
varía entre Vt y Vo.
Coeficiente de distribución (Kd). Representa la fracción de
volumen del interior de las esferas a la que accede cada
sustancia dependiendo de su tamaño.
Kd = Ve-Vo/Vt-Vo
Ventajas y Desventajas
 Tiempos de
separación cortos y
muy bien definidos,
 Bandas estrechas
buena sensibilidad
 No hay pérdida de
muestra
 No se desactiva la
columna por la
interacción del
soluto con el relleno.

Sólo una cantidad limitada de
bandas se puede acomodar
porque la escala de tiempo del
cromatograma es corta.

No sirve con isómeros.
Fase Normal
La cromatografía de fase normal utiliza una
fase estacionaria polar(frecuentemente
hidrofílica) y una fase móvil menos polar.
El componente menos polar se eluye
primero,
Elección de fases
Fase móvil (no polar)
Fase estacionaria (polar)
Fase reversa
se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas
de repulsión entre
o
un solvente –polar
o
un compuesto – apolar
o
fase estacionaria- apolar.
La elución se produce como un reparto de cada componente entre dos solventes no
miscibles.
La fase solida lipofilica y el solvente que circula, es una cromatografía de reparto y no
de adsorción
técnica proporciona retención y selectividad óptimas cuando las muestras tienen un
carácter
predominantemente alifático o aromático.
Fundamento:
El tiempo de retención es mayor para las moléculas
de naturaleza apolar, mientras que las moléculas de carácter
polar eluyen más rápidamente.
La cromatografía de fase reversa es tan utilizada que a
menudo se denomina HPLC sin ninguna especificación
adicional. La
Fundamento:
La fuerza conductora en la unión de compuesto a la
fase estacionaria es la disminución del área del segmento
apolar del analito expuesto al disolvente.
Es decir que la disminución de la energía libre de la
entropía asociada con la minimización de la
interfase compuesto-disolvente polar (efecto hidrofobico)
El efecto hidrofóbico disminuye con la adición de disolvente
apolar a la fase móvil. (modifica el coeficiente de particiónprovocando que el compuesto se mueva por la columna y
eluya.)
Modificadores:
adición de sales inorgánicas provoca un aumento lineal en la tensión
superficial (la entropía de la interfase compuesto-disolvente es
controlada por la tensión superficial)-aumentar el
tiempo de retención.
El pH puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por lo que
se utiliza un tampón como el fosfato de sodio por controlar el valor
del pH y neutralizar la carga (actúan como contraiones) o cualquiera
resto de sílica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta
El tiempo de retención aumenta con el área de superficie
hidrofóbica que suele ser inversamente proporcional al tamaño del
compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir más
rápidamente que sus isómeros lineales puesto que la superficie total
se ve reducida.
Modificadores:
Un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con
un tiempo de retención mayor porque aumenta la
hidrofobicidad de la molécula.
tampón-como el fosfato de sodio por controlar el valor del pH
Ejemplos:
Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor
facilidad que las columnas de sílica normales.
formadas por sílica modificada con cadenas alquil y
no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso ( dañar
el esqueleto de sílica)
Las columnas se pueden utilizar en ácidos en medio acuoso (
no deben estar expuestas un largo tiempo corroen el equipo)
columnas:
Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo
de cromatografía es la sílica tratada con RMe2SiCl, dónde la R
es una cadena alquil tal como C18H37 ó C8H17 que se le ha
injertado.
De este modo las partículas forman una fase lipófila que
retiene las moléculas poco polares.
Fase estacionaria:
El tiempo de retención aumenta con el área de superficie
hidrofóbica que suele ser inversamente proporcional al
tamaño del compuesto.
Los compuestos ramificados suelen eluir más rápidamente que
sus isómeros lineales puesto que la superficie total
se ve reducida.
Fase móvil:
Los eluyentes utilizados son de
polaridad alta a media:
agua
Metanol
Acetonitrilo
MEK
Acetato de etilo
THF
Acetona
Etanol
Ejemplos:
se utiliza para la separación de especies ionizables
se añade a la fase móvil un compuesto iónico que aporta un
contraión orgánico grande; la concentración de estos agentes está en
un rango de 0.01 % a 0.03 %.
la molécula del soluto forma un par iónico con el contraión en la
fase móvil y de esta manera aumenta la hidrofobicidad de la muestra
el contraión se retiene en la fase estacionaria que es
normalmente neutra y le proporciona una carga. Esta fase
estacionaria cargada puede entonces formar complejos con los iones
orgánicos de carga opuesto
Supresión iónica:
La retención aumenta conforme el pH maximiza la concentración
de la forma iónica de los solutos.
Un pH bajo asegura que las bases fuertes estén en su forma
iónica protonada y que los ácidos débiles presentes estén en su
forma no iónica.
Análisis de proteínas –TFA, acido orto fosfórico
Análisis de ácidos nucleicos – trietilamina
Casos en los que se ocupa:
Separación de los siguientes grupos de biomoléculas:
• Proteínas y péptidos de origen natural
• Proteínas y péptidos recombinantes
• Péptidos obtenidos por digestión enzimática
• Péptidos sintetizados químicamente
• Oligonucleótidos sintético
La cuantificación en RPC se basa en la comparación del área del
pico del compuesto problema con las de uno o más estándares
Aplicaciones analíticas:
Apareamiento iónico
es un monitor de progreso de la reacción aplicada
al proceso de validación y producción comercial de un activo
ingrediente farmacéutico
Cromatografía líquida de alta (HPLC) se utiliza comúnmente
para ensayos cuantitativos IPC, y una actual de la industria
la práctica es la validación de estos métodos.
Aplicaciones analíticas:
Bibliografía
D.A. Skoog, J.J. Leary, “Análisis Instrumental”,
McGraw-Hill, Madrid (1996).
http://www.docstoc.com/docs/3248423/CROMATO
GRAFÍA-DE-INTERCAMBIO-IÓNICO-Hay-tres-tiposde-Fases-Estacionariashttp://
www.fing.edu.uy/iq/analisis/cursos/ainst/hplc.pdf
http://books.google.com/books?id=aU_aBXvAB3MC&pg=PA
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ce=bl&ots=yugSpApVbt&sig=zypbpOmqJkUcrbYSYnNfAjQK
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http://es.scribd.com/doc/13588175/Cromatografia
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/cromatografia_
de_fase_reversa.pdf
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